CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.3. Xác định tính chất sinh học của mẫu bùn thải
Xác định tổng số vi sinh vật trong các mẫu bùn thải Nguyên tắc:
Cấy một thể tích xác định dịch pha lỗng bùn thải lên các đĩa thạch chứa mơi
trường thích hợp, đặc trưng và sau đó đếm số lượng khuẩn lạc mọc lên sau khi ủ. Mỗi khuẩn lạc là kết quả của sự phát triển từ một tế bào.
Tiến hành:
+ Chuẩn bị dụng cụ, thiết bị: làm sạch, khử trùng, làm khô các dụng cụ, thiết bị cần thiết như ống nghiệm, bình tam giác, đĩa petri, que gạt,...trước khi sử dụng.
+ Chuẩn bị môi trường nuôi cấy: chuẩn bị các thành phần môi trường; nấu môi trường; hấp khử trùng; bảo quản; đổ môi trường ra đĩa petri, làm nguội tới khoảng 40oC để tạo môi trường thạch đĩa. Các môi trường nuôi cấy được sử dụng để xác định tổng số vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn tương ứng là Thạch dinh dưỡng (NA), Czapeck và Gause I.
+ Chuẩn bị dịch nuôi cấy: mẫu bùn tươi được hịa tan, pha lỗng trong nước muối sinh lý vô trùng (0,9%) ở nồng độ thích hợp.
+ Ni cấy vi sinh vật : lấy 100 μL mẫu đã pha lỗng nhỏ lên trên mơi trường thạch đĩa petri đã khử trùng ở 121oC, 15 phút, sau đó dàn đều bằng que gạt. Nuôi ở 30oC trong 4 - 7 ngày. Đếm số lượng khuẩn lạc tạo thành.
+ Từ số khuẩn lạc đếm được, suy ra số lượng vi sinh theo công thức:
(*)
A Số tế bào vi sinh vật trong 1g mẫu (CFU/g). N Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn. ni Số đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i.
V Thể tích dịch mẫu cấy vào mỗi đĩa. fi Độ pha loãng tương ứng.
Xác định số lượng Escherichia coli bằng kỹ thuật nhiều ống (MPN) Nguyên tắc:
Vi sinh vật mà sau khi được nuôi cấy trong môi trường làm giàu chọn lọc (dạng dịch thể chứa thành phần sodium lauryl sulphate và lactose với bromocresol tím làm chỉ thị màu cho tính acid) ở 36oC có thể phát triển trong brilliant green bile broth 2% và dương tính với phản ứng indole trong nước tryptone ở 44 °C được cho là
E.coli.
Chuẩn bị mẫu:
+ Chuẩn bị dung dịch pha loãng 10 lần của mẫu ban đầu bằng cách sau: - Cho 10g bùn thải tươi, đã đồng nhất 1mm vào một bình tam giác vơ trùng. - Thêm khoảng 45ml dung dịch pha loãng mẫu. Đồng nhất dịch huyền phù. - Thêm dung dịch pha loãng mẫu vào bình tam giác trên cho đến thể tích cuối cùng là 90ml. Đồng nhất dịch huyền phù và dãn nhãn dung dịch A.
+ Chuẩn bị dung dịch pha loãng 1000 lần của mẫu ban đầu bằng cách sau:
Lấy 10ml dung dịch A, cho vào một bình tam giác vô trùng khác, thêm 90ml dung dịch pha loãng mẫu. Đồng nhất dịch huyền phù và dán nhãn dung dịch B.
Cấy mẫu vào ống nghiệm: 5 dãy ống nghiệm.
Dãy ống nghiệm thứ nhất: gồm 5 ống, mỗi ống chứa 10ml lauryl tryptose broth với chỉ thị bromocresol tím và 10ml dung dịch A. Dãy ống nghiệm này chứa 1g bùn tươi/ ống.
Dãy ống nghiệm thứ hai: gồm 5 ống, mỗi ống chứa 10ml lauryl trytose broth với chỉ thị bromocresol tím (hỗn hợp này đã pha lỗng 2 lần so với dãy thứ nhất, ký hiệu là x1) và 1ml dung dịch A. Dãy ống nghiệm này chứa 0,1g bùn tươi/ống.
Dãy ống nghiệm thứ ba: gồm 5 ống, mỗi ống chứa 10ml lauryl tryptose broth với chỉ thị bromocresol tím (x1) và 1ml dung dịch B. Dãy ống nghiệm này chứa 0,01g bùn tươi/ống.
Dãy ống nghiệm thứ tư: gồm 5 ống, mỗi ống chứa 10ml lauryl tryptose broth với chỉ thị bromocresol tím (x1) và 0,1ml dung dịch B. Dãy ống nghiệm này chứa 0,001g bùn tươi/ống.
Dãy ống nghiệm thứ năm: gồm 5 ống, mỗi ống chứa 10ml lauryl tryptose broth với chỉ thị bromocresol tím (x1) và 0,01ml dung dịch B. Dãy ống nghiệm này chứa 0,0001g bùn tươi/ống.
Nuôi, bảo quản, ghi nhận ống sau cấy:
Đậy nắp ống nghiệm, đặt trong tủ ấm ở 36oC. Thời gian nuôi: 18 – 24 giờ.
Sau thời gian ni cấy, kiểm tra sự hình thành axit (xuất hiện màu vàng). Những ống hình thành axit được ghi nhận là dương tính và được xem là chứa E.coli giả định và được sử dụng cho thử nghiệm xác nhận tiếp sau đó. Những ống còn lại được xem là âm tính.
Test xác nhận:
Mỗi ống dương tính được cấy vào hai ống mơi trương khác: một ống chứa 10ml brilliant green bile broth, nuôi cấy ở 44oC trong 18 – 24 giờ và một ống chứa 10ml nước tryptone, nuôi cấy ở 44oC trong 21 ± 3 giờ. Mỗi ống môi trường này được bổ sung 1ml dung dịch từ ống dương tính, và nút kín.
+ Sự hiện diện của E.coli được chứng minh qua hiện tượng bị vẩn đục trong
môi trường brilliant green bile broth và tạo indole trong nước tryptone (xuất hiện một cách nhanh chóng màu đỏ đậm ở tầng trên sau khi nhỏ thêm 0,2 – 0,3ml thuốc thử Kovac).
Đọc kết quả:
Từ kết quả kiểm tra, đối chiếu với bảng tra cứu (Phụ lục 1), để xác định chỉ số MPN của E.coli trong 10g bùn thải tươi.
Xác định số lượng Salmonella và Shigella trên môi trường thạch Salmonella – Shigella chọn lọc
Nguyên tắc:
Thạch Samonella – Shigella (SS) là môi trường nuôi cấy chọn lọc cho Samonella và một vài chủng Shigellla từ mẫu xét nghiệm.
Những vi sinh vật này được nhận diện trên môi trường thạch SS bằng đặc điểm khuẩn lạc mọc trên môi trường:
+ Khuẩn lạc Samonella: khơng màu, có điểm đen ở giữa khuẩn lạc (do vi
khuẩn này sinh ra hydrogen sulfid) nhưng không lên men đường lactose.
+ Khuẩn lạc Shigella : khơng màu, khơng có chấm đen ở giữa khuẩn lạc (do vi khuẩn này không sinh ra hydrogen sulfid) và cũng khơng lên men đường lactose.
Tiến trình thực hiện:
Chuẩn bị dung dịch mẫu cấy:
Lấy 1g bùn tươi hịa tan, pha lỗng bằng nước cất vô trùng thành các dung dịch với độ pha lỗng thích hợp.
Cấy, nuôi mẫu:
Lấy 100 μL mẫu đã pha loãng nhỏ lên trên môi trường thạch đĩa petri đã khử trùng ở 121oC, 15 phút, sau đó dàn đều bằng que gạt. Ni mẫu ở 35 – 37o
C trong 18 – 24 giờ.
Đếm số lượng:
Từ số lượng khuẩn lạc Salmonella hoặc Shigella xuất hiện trên thạch SS suy ra số lượng tế bào trong 1 g mẫu bùn tươi theo công thức (*).
Xác định số lượng vi khuẩn E.coli O157:H7 trên môi trường thạch MacConkey Sorbitol
Nguyên tắc:
Thạch MacConkey Sorbitol được khuyến nghị sử dụng để phân lập Escherichia coli O157:H7. Chủng này là chủng vi khuẩn đường ruột gây bệnh xuất huyết đại tràng ở người, có thể lên men lactose những khơng lên men sorbitol. Vì vậy sẽ hình thành các khuẩn lạc khơng màu, trong khi phần lớn các chủng E.coli khác lại có khả
năng lên men sorbitol nên sẽ hình thành khuẩn lạc có màu hồng trên môi trường thạch MacConkey Sorbitol có chứa chỉ thị đỏ trung tính.
Tiến trình thực hiện:
Chuẩn bị dung dịch mẫu cấy:
Lấy 1g bùn tươi đã đồng nhất, hịa tan, pha lỗng bằng nước cất vơ trùng thành các dung dịch mẫu cấy với các độ pha lỗng thích hợp.
Cấy, ni mẫu:
Lấy100µL dung dịch mẫu, nhỏ lên mơi trường thạch đĩa, rồi gạt đều bằng que gạt. Nuôi ở 35 – 37oC trong 18 – 24 giờ.
Đếm số lượng:
Từ số lượng khuẩn lạc Escherichia coli O157:H7 xuất hiện trên thạch MacConkey Sorbitol suy ra số lượng tế bào trong 1g mẫu bùn tươi.
Xác định số lượng kí sinh trùng Cryptosporidium parvum, Giandia intestinalis và Cyclospora spp.
Cách tiến hành: Xử lý mẫu:
Lấy 10g mẫu vào túi nilon (túi dập mẫu).
Thêm 100ml Tween 20 nồng độ 0,01% vào túi sao cho toàn bộ mẫu ngập trong dung dịch này.
Đập mẫu trong 30 giây bằng máy đập Pulsifier. Sau đó chắt lấy dung dịch từ túi mẫu, cho vào 2 tuýp Falcon 50ml.
Li tâm 3500 vòng/phút trong 10 phút. Hút dung dịch ra khỏi 2 tuýp, chỉ để lại 5ml dung dịch trong mỗi tuýp.
Lặp lại bước 2.
Đập lại mẫu trong 10 giây, chuyển toàn bộ dung dịch vào 2 tuýp Falcon như ở trên.
Ly tâm 3500 vòng/phút trong 10 phút. Tuýp thứ nhất (tuýp 1): hút dung dịch ra, chỉ để lại khoảng 5ml. Tuýp thứ hai (tuýp 2): để lại khoảng 15ml. Chuyển 5ml ở tuýp 1 sang tuýp 2. Rửa tuýp 1 hai lần với 5ml nước cất và chuyển sang tuýp 2.
Lặp lại bước 4 đối với tuýp 2.
Trộn đều dịch trong ống và chuyển sang tuýp Falcon 15ml thứ 3 (tuýp 3).
Loại bỏ các cặn lớn trong dịch trên bằng cách: lấy 1 pipet Pasteur đặt vào tuýp li tâm thứ 3 và cho 5ml dung dịch làm nổi với tỷ lệ 1:1 vào pipet Pasteur, dung dịch làm nổi ở đáy của tuýp.
Li tâm 100 vòng/phút trong 1 phút.
Chuyển toàn bộ dung dịch sang tuýp Falcon thứ 4 (tuýp 4).
Li tâm 3500 vòng/phút trong 10 phút. Hút từ từ dịch ra, chỉ để lại 2ml cặn. Sau đó đổ đầy tuýp bằng nước cất. Lặp lại bước này lần nữa.
Li tâm 3500 vòng/phút trong 10 phút. Hút dịch ra, chỉ để lại khoảng 2ml cặn.
Xác định Cryptosporidium parvum và Giardia intestinalis:
Nhuộm màu và đếm:
+ Lắc đều dung dịch, nhỏ 200µL lên lam kính.
+ Để khơ lam kính ở tủ ấm 37oC trong 2 – 3 giờ hoặc để ở nhiệt độ phòng qua đêm.
+ Cố định tiêu bản bằng axeton trong giemsa khoảng 5 phút, sau đó để khơ ở nhiệt độ phịng.
+ Gắn màu với kít kháng thể miễn dịch huỳnh quang. Làm khô và nhỏ dung dịch đệm, để ở nhiệt độ phịng.
+ Thêm 20µL thuốc nhuộm vào từng giếng lam kính sao cho thuốc nhuộm phủ toàn bộ giếng.
+ Ủ ở 37oC khoảng 45 phút trong một khay ẩm ở trong bong tối.
+ Hút thuốc nhuộm từ mỗi giếng bằng pipet mới đặt ở thành giếng. Sau đó nhỏ 100µL dung dịch đệm PBS vào mỗi giếng và rửa 2 lần. Sau lần rửa thứ 2 thêm 6µL dung dịch đệm vào mỗi giếng và đặt lamen lên trên sao cho tránh có bọt.
+ Lam kính được giữ ở trong bong tối đến khi đếm bào nang dưới kính hiển vi huỳnh quang vật kính 20x.
+ Trộn đều dịch huyền phù và nhỏ 22µL lên lam kính.
+ Đặt la men lên trên lam kính và đếm bào nang Cyclospora spp. dưới kính hiển
vi huỳnh quang vật kính 40x.
Xác định số lượng ký sinh trùng Taenia saginata bằng phương pháp Romanenko
Ngun lí:
Trứng giun có tỷ trọng nhẹ hơn nước muối bão hòa nên nổi lên trên dung dịch nước muối bão hịa đó.
Tiến hành:
+ Cân 100g mẫu, chia làm 4 phần đều nhau, mỗi phần 25g. + Tán nhỏ 25g mẫu, đưa vào ống li tâm có dung tích 250ml.
+ Đổ dung dịch NaOH 0,5% cho đầy ống, khuấy trộn đều khoảng 30 phút.
+ Li tâm hỗn hợp trên với tốc độ 1000 – 1500 vịng/phút, trong 5 phút. Sau đó loại bỏ phần lỏng.
+ Đổ dung dịch NaNO3 bão hòa vào các ống chứa mẫu, khuấy trộn kĩ trong 10 phút, rồi li tâm với tốc độ 1000 vòng/phút trong 5 phút.
+ Đổ dung dịch NaNO3 bão hòa cho đầy ống nghiệm đến khi mặt nước tạo vồng lên miệng.
+ Đặt lam kính 1 lên miệng ống, trong 20 phút.
+ Nhấc lam kính 1 ra, đặt tiếp lam kính 2 lên trong 7 phút. Mỗi lam kính cần có 1 giọt cịn đọng trên mặt khi nhấc khỏi miện ống.
+ Nhỏ một giọt Glyxerin 50% phủ lên giọt nước cịn động đó.
+ Đậy lá kính lên giọt nước rồi đem soi trên kính hiển vi vật kính 10x để phát hiện trứng giun sán và quan sát chi tiết ở vật kính 40x.
+ Đếm số trứng trên các tiêu bản của mẫu phân tích, và đánh giá mức độ cịn tốt hay đã hỏng. các giai đoạn phát triển của trứng. Ghi nhận kết quả.