Qua kết quả nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy rằng trong các nhóm vi sinh vật nghiên cứu, số chủng vi khuẩn ưa nhiệt có hoạt lực phân hủy chất hữu cơ rất mạnh đạt tỉ lệ cao nhất. Đặc biệt chủng vi khuẩn V18 có hoạt lực phân hủy rất mạnh đối với cả ba nguồn chất hữu cơ là tinh bột, protein và cellulose với đường kính vạch phân hủy tương ứng đạt 29 mm, 29 mm và 28 mm. Theo kết quả nghiên cứu của Ngô Thị Tường Châu (2011) và Ngơ Thị Tường Châu (2013) thì chủng vi khuẩn V18 này có khả năng phân hủy các nguồn chất hữu cơ cao hơn nhiều so với các chủng vi sinh vật được phân lập và tuyển chọn từ mẫu bùn ao nuôi tôm ở Thừa Thiên Huế.
Từ các kết quả nêu trên, chúng tôi chọn chủng vi khuẩn ưa nhiệt bao gồm V18, M5X2 và GW4 cho các nghiên cứu tiếp theo. Ta cũng thấy được bùn thải từ nhà máy giấy Bãi Bằng có các chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột, protein và cellulose cao, nên tôi chọn bùn thải của nhà máy giấy Bãi Bằng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.3.4. Khả năng đối kháng giữa các chủng vi khuẩn ưa nhiệt được tuyển chọn Tất cả các chủng vi khuẩn V18, M5X2 và GW4 được tuyển chọn được cấy lên Tất cả các chủng vi khuẩn V18, M5X2 và GW4 được tuyển chọn được cấy lên môi trường NA bằng phương pháp cấy vng góc và ni cấy ở 50o
Đánh giá sự hình thành các vùng ức chế sự phát triển do hoạt động đối kháng của các chủng vi khuẩn. Kết quả cho thấy khơng có sự đối kháng giữa các chủng vi khuẩn này. Vì vậy có thể sử dụng đồng thời các chủng vi khuẩn này dưới dạng một tập hợp chủng cho các nghiên cứu liên quan.
3.4. Đánh giá khả năng phân hủy bùn thải của các chủng vi khuẩn ưa nhiệt đã tuyển chọn đã tuyển chọn
Khả năng phân hủy bùn thải của các chủng vi khuẩn ưa nhiệt được đánh giá bằng độ giảm khối lượng bùn thải sau khi ủ
3.4.1. Đánh giá khả năng phân hủy bùn thải từ nhà máy giấy Bãi Bằng của chủng vi khuẩn GW4 vi khuẩn GW4
Bảng 7. Khả năng phân hủy bùn thải của chủng vi khuẩn ưa nhiệt GW4 Thời gian Thời gian
(ngày) 2 3 4 6 8
Đối chứng 0 7% 8% 10,5% 15,5%
Hình 15. Biểu đồ so sánh độ giảm khối lượng bùn theo thời gian giữa mẫu bùn thí nghiệm được bổ sung chủng vi khuẩn GW4 và mẫu bùn đối chứng (ĐC) Hình 15 cho thấy % khối lượng bùn trong mẫu thí nghiệm được cấy bởi tập hợp vi khuẩn ưa nhiệt đã giảm hơn nhiều so với mẫu đối chứng trong quá trình ủ ở 60o
C. Tốc độ giảm khối lượng của bùn tăng tuyến tính đến ngày thứ 8 của quá trình ủ. Phần chất rắn của bùn thải đã giảm khoảng 36% sau 8 ngày ủ. Trong mẫu đối chứng chỉ khoảng 15,5% phần chất rắn đã được giảm sau 8 ngày ủ. Như vậy, sau thời gian ủ là 8 ngày, độ phân hủy của mẫu chưa vi khuẩn ưa nhiệt đã nhanh hơn gấp 2,3 lần mẫu đối chứng. Theo quan sát, các chỉ số về giảm độ đục, lượng giấy bị phân hủy của mẫu thí nghiệm cũng cao hơn nhiều so với mẫu đối chứng. Điều này cho thấy sự có mặt của vi khuẩn ưa nhiệt trong mẫu phân tích có vai trị quan trọng trong việc tăng tốc độ phân hủy sinh khối, xúc tác các quá trình xảy ra trong quá trình ủ.
0% 5% 10% 15% 20% 25% 30% 35% 40% 2 3 4 6 8 Độ giảm k h ối lượng b ù n thải ( % )
Thời gian (ngày)
Thí nghiệm Đối chứng
3.4.2. Đánh giá khả năng phân hủy bùn thải từ CTCP mía đường Hịa Bình của chủng vi khuẩn M5X2.
Bảng 8. Khả năng phân hủy bùn thải của chủng vi khuẩn M5X2
Thời gian (ngày) 1 3 4 5 7
Thí nghiệm 1.1% 4.55% 6% 6.8% 7.5%
Đối chứng 0.05% 1% 1.01% 1.03% 1.2%
Hình 16. Biểu đồ so sánh độ giảm khối lượng bùn theo thời gian giữa mẫu bùn thí nghiệm được bổ sung chủng vi khuẩn M5X2 và mẫu bùn đối chứng (ĐC) Hình 16 cho thấy % khối lượng bùn trong mẫu thí nghiệm được cấy chủng vi khuẩn ưa nhiệt M5X2 ,đã giảm hơn nhiều (7,5%) so với mẫu đối chứng (1,2%) trong quá trình ủ ở 60oC. Tốc độ giảm khối lượng của bùn tăng tuyến tính đến ngày thứ 4 và sau đó tăng chậm dần đến ngày thứ 7 của quá trình ủ.
0.00% 1.00% 2.00% 3.00% 4.00% 5.00% 6.00% 7.00% 8.00%
Ngày 1 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5 Ngày 7
Độ giảm k h ối lượng b ù n thải ( % )
Thời gian (ngày)
Thí nghiệm Đối chứng
3.4.3. Đánh giá khả năng phân hủy bùn thải nhà máy tinh bột sắn Fococev Thừa Thiên Huế của chủng vi khuẩn V18 Thiên Huế của chủng vi khuẩn V18
Bảng 9: Khả năng phân hủy bùn thải của chủng vi khuẩn V18 Thời gian Thời gian
(ngày) 2 3 6 8 10
Thí nghiệm 7,5% 12,5% 25% 30% 33%
Đối chứng 2,5% 6,5% 12,75% 21% 25%
Hình 17: Biểu đồ so sánh độ giảm khối lượng bùn theo thời gian giữa mẫu bùn thí nghiệm được bổ sung chủng vi khuẩn V18 và mẫu bùn đối chứng (ĐC)
Hình 17 cho thấy % khối lượng bùn trong mẫu thí nghiệm được cấy chủng vi khuẩn ưa nhiệt V18, đã giảm hơn nhiều (33%) so với mẫu đối chứng (25%) trong quá trình ủ ở 60oC. Tốc độ giảm khối lượng của bùn tăng tuyến tính đến ngày thứ 8 và sau đó tăng chậm dần đến ngày thứ 10 của quá trình ủ.
0.00% 5.00% 10.00% 15.00% 20.00% 25.00% 30.00% 35.00% 2 3 6 8 10 Độ giảm k h ối lượng b ù n thải ( % )
Thời gian (ngày)
Thí nghiệm Đối chứng
3.4.4. Đánh giá khả năng phân hủy bùn thải của tập hợp các chủng vi khuẩn ưa nhiệt được tuyển chọn
Bởi vì khơng có sự đối kháng giữa các chủng vi khuẩn ưa nhiệt được tuyển chọn, chúng tôi tiến hành đánh giá khả năng phân hủy bùn thải nhà máy giấy Bãi Bằng của tập hợp các chủng nêu trên. Kết quả được trình bày ở bảng 10 hình 18
Bảng 10: Khả năng phân hủy bùn thải của tập hợp các chủng vi khuẩn Thời gian Thời gian
(ngày) 2 3 6 8 10
Thí nghiệm 5% 7,5% 22,5% 45,5% 52,5%
Đối chứng 2,5% 5% 15% 22% 30%
Hình 18: Biểu đồ so sánh độ giảm khối lượng bùn theo thời gian giữa mẫu bùn thí nghiệm được bổ sung tập hợp các chủng vi khuẩn và mẫu bùn đối chứng Hình 18 cho thấy % khối lượng bùn trong mẫu thí nghiệm được cấy bởi hỗn hợp vi khuẩn ưa nhiệt đã giảm hơn nhiều so với mẫu đối chứng trong quá trình ủ ở 60o
C. 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 2 3 6 8 10 Độ giảm k h ối lượng b ù n (% )
Thời gian (ngày) Thí nghiệm Đối chứng
Tốc độ giảm khối lượng của bùn tăng tuyến tính đến ngày thứ 8 và sau đó tăng chậm hơn ở ngày thứ 10 của quá trình ủ.
3. 5. Định danh các chủng vi khuẩn được tuyển chọn.
Các bước định danh vi khuẩn: Mẫu cấy thuần
Đem ly trích được DNA của VK.
Đo nồng độ DNA (25- 500ng/ reaction) bằng máy Biophotometer.
Lấy 5ul mẫu cho vào phản ứng PCR để khuếch đại đặc hiệu đoạn DNA dài 500 bp trên vùng gen 16S rRNA bằng hệ thống máy PCR Thermal Cycler của Bio- Rad => sản phẩm PCR có kích thước khoảng 550bp
Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 2% ,chụp hình bằng hệ thống máy Gel Doc của Bio –Rad.
Tinh sạch sản phẩm PCR bằng bộ QIA quick PCR Purification Kit của QIAGEN.
Điện di sản phẩm đã tinh sạch bằng máy hệ thống máy Agilent 2100 Bioanalyzer
PCR SEQ sản phẩm đã tinh trước khi giải trình tự trên hệ thống máy ABI 3130XL
Phân tích kết quả bằng phần mềm Sequecing analysis 5.3 , và so với kết quả trên ngân hàng Gen.
Kết quả định danh mẫu vi khuẩn M5X2
GRAM BA
Kết quả giải trình tự gien 16S của mẫu M5X2 xem phụ lục số 8.
KẾT LUẬN : Bacillus subtilis
Kết quả định danh mẫu vi khuẩn GW4
GRAM BA
Kết quả giải trình tự gien 16S mẫu GW4 xem phụ lục số 9.
Kết quả định danh mẫu vi khuẩn V18
GRAM BA
Kết quả giải trình tự gien 16S mẫu V18 xem phụ lục số 10.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận
1. Đã xác định được đặc tính lý, hóa và sinh học của bùn thải từ nhà máy giấy Bãi Bằng, CTCP mía đường Hịa Bình và nhà máy tinh bột sắn Fococev Thừa Thiên Huế. Qua đó, xác lập được cơ sở khoa học cho việc tái sử dụng các loại bùn đó để sản xuất phân bón hữu cơ.
2. Đã phân lập được 11 chủng vi khuẩn ưa nhiệt từ bùn thải nhà máy giấy Bãi Bằng, 11 chủng vi khuẩn ưa nhiệt từ bùn thải CTCP mía đường Hịa Bình và 78 chủng vi khuẩn ưa nhiệt từ bùn thải nhà máy tinh bột sắn Fococev Thừa Thiên Huế
3. Đã tuyển chọn được 3 chủng vi khuẩn ưa nhiệt kí hiệu GW4, M5X2, V18 tương ứng từ mẫu bùn thải của nhà máy giấy Bãi Bằng, CTCP mía đường Hịa Bình và nhà máy tinh bột sắn Fococev Thừa Thiên Huế có hoạt lực phân hủy rất mạnh trong cả 3 nguồn cellulose, tinh bột và protein, đồng thời không phát hiện sự đối kháng giữa chúng
4. Việc bổ sung từng chủng vi khuẩn GW4, M5X2 và V18 đã làm giảm khối lượng bùn tương ứng là 36%, 7,5% và 33% so với mẫu đối chứng. Đặc biệt, trong trường hợp bổ sung tập hợp 3 chủng nói trên thì đã làm giảm đáng kể lượng bùn thải của nhà máy giấy Bãi Bằng (52,5%) so với mẫu đối chứng.
5. Ba chủng vi khuẩn ưa nhiệt nói trên đã được định danh và đều thuộc loài
Bacillus subtilis.
2. Kiến nghị
- Tiếp tục phân lập và tuyển chọn thêm các chủng vi sinh vật ưa nhiệt có khả năng phân giải chất hữu cơ từ các mẫu bùn thải khác nhằm tạo tập hợp giống vi khuẩn ưa nhiệt có tiềm năng sử dụng trong sản xuất phân bón hữu cơ chất lượng cao từ bùn thải.
- Tối ưu hóa điều kiện sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn ưa nhiệt để tạo chế phẩm, sử dụng trong thực tiễn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
[1] Ngô Thị Tường Châu (2013), Công nghệ sinh học môi trường, Nxb Đại học Huế, Thừa Thiên Huế.
[2] Bộ Khoa học và Công nghệ (2010), TCVN 8560:2010, Phân bón - Phương pháp xác định Kali hữu hiệu, Hà Nội.
[3] Ngô Thị Tường Châu (2013), ‘‘Nghiên cứu xạ khuẩn phân hủy chất hữu cơ phân lập từ bùn ao nuôi tôm tại huyện Quảng Điền, tỉnh Thừa Thiên Huế’’,
Tạp chí Khoa học Tự nhiên và Cơng nghệ - ĐHQGHN.
[4] Ngô Thị Tường Châu, Phạm Thị Ngọc Lan, Phan Thị Thảo Ly, Lê Văn Thiện, Vũ Thị Lan Phương (2014), ‘‘Nghiên cứu vi sinh vật ưa nhiệt cho sản xuất phân bón hữu cơ từ bùn thải nhà máy tinh bột sắn Fococev Thừa Thiên Huế’’, Báo cáo khoa học về sinh thái và tài nguyên sinh vật, Nxb Khoa học Tự Nhiên và Công Nghệ, Hà Nội.
[5] Ngô Thị Tường Châu (2011), ‘‘Phân lập và đặc tính hóa vi sinh vật đối kháng với các loài vi khuẩn gây bệnh thuộc giống Vibrio từ môi trường ao nuôi tôm ở tỉnh Thừa Thiên Huế’’, Báo cáo tổng hợp kết quả thực hiện nghiên
cứu cơ bản trong khoa học tự nhiên (Quỹ Nafosted), mã số đề tài: 106.03.59.09.
[6] Ngô Thị Tường Châu, Lê Văn Thiện, Hoàng Thị Mỹ Hằng, Phạm Minh Hằng (2014), ‘‘Nghiên cứu vi khuẩn ưa nhiệt phân lập từ bùn thải nhà máy giấy Bãi Bằng’’, Báo cáo khoa học về sinh thái và tài nguyên sinh vật, Nxb Khoa học Tự Nhiên và Công Nghệ, Hà Nội.
[7] Ngô Thị Tường Châu (2013), Công nghệ sinh học Môi trường, NXB Đại
học Huế.
[8] Nguyễn Lân Dũng, Bùi Việt Hà (11/03/2009), ‘‘Sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật’’, http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/vsv14.htm
Đất - Nước - Phân bón - Cây trồng, NXB Giáo Dục, Hà Nội.
[10] Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thanh Hiền, Phạm Văn Ty (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tập 2.
Tài liệu nước ngoài
[11] Ahlawat O. P., Vijay B. (2010) Potential of thermophilic bacteria as microbial inoculant for commercial scale white button mushroom (Agaricus
bisporus) compost production. Journal of Scientific & Industrial Research, 69, 948-
955.
[12] Balasundaran M. (2008), Development of microbial inoculants for aerobic composting, KFRI Research Report No 324.
[13] Bitton, Gabriel (1994) Wastewater Microbiology. pp.166, 352. Wiley-Liss, Inc. 605 Third Avenue, New York, NY 10518-0012.
[14] Brady N.C., Well R.R. (1996) The nature and properties of soils. Prentice Hall international Inc., New Jersey.
[15] Chino M., Kanazawa S., Mori T., Araragi M., Kanke B. (1983) Biochemical studies on composting of minicipal sewage sludge mixed with rice hull. Soil Sci.
Plant Nutr., 29, 159-173.
[16] Environmental Protection Agency (1998) An Analysis of Composting as an Environmental Remediation Technology. In US EPA Solid Waste and Emergency Response (5305W) EPA 530-R-98-008, April 1998, 2-38.
[17] Fu YiGang, Wang Feng, He PeiSong, Xia SiQing, Zhao JianFu (2005) Analysis of microbial community structure with DGGE sludge compost technology.
China Environmental Science, 25 (Suppl.), 98-101.
[18] Gaur A.C., Sadasivam K.V. (1993) Theory and practical considerations of composting organic wastes. In: Thampan P.K., Ed., Organics in Soil Health and Crop Production, Peekay Tree Crops Development Foundation, Cochin, 1-22.
[19] Gaur A.C., Singh G. (1995) Recycling of rural and urban wastes through conventional and vermicomposting. In: Tandon H.L.S., Ed., Recycling of Crop, Animal, Human
and Industrial Wastes in Agriculture, FDCO, New Delhi, India, 31-
[20] Gaur A.C. (1982) A Manual of Rural Composting. Field Document No.15, FAO, Rome.
[21] He M., Tian G., Liang X. (2009) Phytotoxicity and speciation of copper, zinc and lead during the aerobic composting of sewage sludge, J. Hazard. Mater., 163,
671-677.
[22] Krzysztof Ziemiński, Paweł Boniecki (2011) Intensification of sewage sludge composting. Biotechnol. Food Sci., 75 (1), 15-28.
[23] Liu J., Xu X., Huang D., Zeng G. (2009) Transformation behavior of lead fractions during composting of lead-contaminated waste. Trans. Nonferrous Met. Soc. China, 19, 1377-1382.
[24] Nair A., Juwarkar A.A., Devotta S. (2008) Study of speciation of metals in an industrial sludge and evaluation of metal chelators for their removal. J. Hazard.
Mater., 152, 545-553.
[25] Nakasaki K., Sasaki M., Shoda M., Kubota H. (1985) Change in microbial numbers during thermophilic composting of sewage sludge with reference to CO2 evolution rate. Appl Environ Microbiol., 49(1), 37-41.
[26] Radtke T.M., Gist G.L. (1989) Wastewater sludge disposal: antibiotic resistant bacteria may pose health hazard. Journal of Environmental Health., 52 (2), 102-105.
[27] Shigeru Kume (1994) Thermophilic bacteria and their enzymes based on sewage sludge composting. Master Thesis of Kyushu University, Japan.
[28] Singh A., Sharma S. (2003) Effect of microbial inocula on mixed solid waste composting, vermicomposting and plant response. Compost Sci. Util., 11,
[29] Siuta J. (2001) Osady ściekowe – sposoby przyrodniczego użytkowania.
BMP Ochrona Środowiska, 174, 32-33.
[30] Sterritt, Robert M. (1988) Microbiology for Environmental and Public Health Engineers. P. 242, 251-2. E. & F. N. Spon Ltd., New York, NY 10001 USA.
[31] Tiwari V.N. (1989) Composting of dairy farm wastes and evaluation of its manurial value. Proceedings of National Academy of Sciences, India, 59, 109-114.
[32] U.S. Environmental Protection Agency. 1993. Methods for microbiological analyses of sewage sludge.
[33] Willson G.B., Dalmat D. (1983), Sewage sludge composting in the U.S.A,
BioCycle.
[34] Wong J.W.C., Li S.W.Y., Wong M.H. (1995) Coal fly ash as a composting material for sewage sludge: Effects on microbial activities. Environ. Technol., 16,
527-537.
[35] Wong J. W. C., Selvam A. (2006) Speciation of heavy metals during co- composting of sewage sludge with lime. Chemosphere, 63, 980-986.
[36] Xiao-Ying XU, LI Ji (2006) Application of complex microbial inoculants in the high-temperature and aeration composting sewage sludge. Chinese Journal of Eco-Agriculture, 3.
[37] Yusaku Fujio, Shigeru Kume (1991), Isolation and identification of thermophilic bacteria from sewage sludge compost, J. Ferment. Bioeng, tr. 72-334. Zeng G. M., Huang D. L., Huang G. H., Hu T. J., Jiang X. Y., Feng C. L., Chen Y. N., Tang L., Liu H. L. (2007) Composting of lead-contaminated solid waste with inocula of white-rot fungus. Bioresour. Technol., 98, 320-326.
[38] Zorpas, A.A., Vlyssides A.G., Loizidou M. (1999) Dewatered anaerobically stabilized primary sewage sludge composting: leachability and uptake by natural clinoptilolite. Commun. Soil Sci. Plant Anal., 30, 1603-1613.
PHỤ LỤC
Phụ lục 1 : Bảng đối chiếu xác định E.Coli tổng số bằng phương pháp ngoại suy từ các ống nghiệm có biểu hiện dương tính sau khi kiểm tra
Phụ lục 2 : Thành phần các môi trường phân lập vi khuẩn ưa nhiệt
Nutrient Broth Agar (NA) %
Trypticase Soy Agar (TSA) % EG Agar % Cao thịt 0,3 Pepton 0,5 Agar 1,5 Tryptone 1,5 Soytone 0,5 NaCl 0,5 Agar 1,5 Cao thịt 0.26 Pepton 1.0 Cao nấm men 0.5 Na2HPO4 0.4 Glucose 0.15 Tinh bột tan 0.05 L- cystein 0.02 L-cystein HCl 0.05 Chất phá bọt 0.02 Tween 80 0.05 Agar 1.5
Phụ lục 3 : Môi trường thạch MacConkey Sorbitol dùng để xác định số lượng vi khuẩn E.coli O157: H7
Phụ lục 4 : Các thiết bị sử dụng chính trong q trình nghiên cứu phân lập vi khuẩn ưa nhiệt
Phụ lục số 5: Q trình phân lập và ni cấy giữ giống vi khuẩn
Phân lập vi khuản ưa nhiệt trên các môi trường thạch
Phụ lục số 6
QUY ĐỊNH MỨC TỐI THIỂU CHẤT LƯỢNG CHÍNH VÀ MỨC TỐI ĐA YẾU TỐ HẠN CHẾ TRONG PHÂN BÓN HỮU CƠ, PHÂN BÓN KHÁC