CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.5. Phương pháp tuyển chọn các chủng vi khuẩn ưa nhiệt có hoạt lực phân hủy
chất hữu cơ cao từ các chủng được phân lập
Nguyên tắc:
Các chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy chất hữu cơ cao được tuyển chọn từ các chủng vi khuẩn ưa nhiệt phân lập được bằng phương pháp khuếch tán enzyme trên môi trường thạch đĩa. Trong đó, các đĩa thạch chứa mơi trường thạch cao thịt – pepton được bổ sung riêng biệt 1% tinh bột, 1% CMC (carboxymethyl cellulose) và 1% casein tương ứng với việc tuyển chọn các chủng phân hủy tinh bột, cellulose và protein. Cấy vạch các chủng vi khuẩn được phân lập lên các đĩa thạch nói trên. Ni cấy ở 35 – 500
C trong 3 ngày. Sau đó, nhuộm các đĩa thạch có bổ sung tinh bột và CMC bằng thuốc nhuộm Lugol và casein bằng thuốc thử Fraziae (phụ lục 2). Đánh giá khả năng phân hủy các chất hữu cơ thông qua giá trị hiệu số giữa kích thước vạch phân hủy cơ chất (D) và kích thước khuẩn lạc (d). Từ đó, tuyển chọn các
chủng có khả năng phân hủy tinh bột, cellulose và protein cao nhất trong số các chủng được phân lập.
Tiến hành:
- Chuẩn bị môi trường thạch đĩa - Chuẩn bị thuốc thử
- Cấy truyền chủng vi khuẩn: từ các ống giữ giống, mỗi chủng ta chọn ra một ống, dùng que cấy vô trùng lấy một lượng rất nhỏ tế bào vi khuẩn và cấy truyền dạng vạch lên mặt thạch đĩa của ba môi trường kiểm chứng.
Mỗi đĩa tối đa cấy ba vạch của ba chủng, các vạch cách xa nhau nhất có thể.
- Ni: các đĩa sau khi cấy được ủ ở 35oC và 50oC, từ 1 – 3 ngày.
- Nhuộm màu, ghi nhận kết quả: ghi nhận đường kính của các khuẩn lạc (d) và đường kính phân giải (D) chất bổ sung của chúng.
- Chọn chủng: căn cứ vào hiệu số phân giải D – d và tỉ lệ D/d để chọn ra 3 chủng
có khả năng phân giải tốt nhất đối với 3 loại chất cellulose, protein và casein. 2.2.6. Phương pháp kiểm tra tính đối kháng giữa các chủng vi khuẩn ưa nhiệt Các chủng vi sinh vật ưa nhiệt sau khi được tuyển chọn đem cấy trên môi trường thạch – cao thịt – peptone theo phương pháp cấy vạch thẳng vng góc và ni cấy ở 50oC trong 4 ngày. Kiểm tra vòng ức chế phát triển của vi khuẩn do hoạt động đối kháng giữa các chủng vi khuẩn (nếu có).
2.2.7. Phương pháp đánh giá khả năng phân giải bùn của các chủng vi khuẩn ưa nhiệt đã tuyển chọn nhiệt đã tuyển chọn
Nguyên lí:
Các chủng vi khuẩn ưa nhiệt được nuôi cấy trong môi trường bùn (pH ban đầu được điều chỉnh đến 7,5-8,0) ở 60oC trong 10 ngày. Tính % độ giảm trọng lượng khơ của bùn sau mỗi ngày ni cấy tại điều kiện thí nghiệm và đối chứng (không cấy vi khuẩn ưa nhiệt).
2.2.8. Phương pháp định danh vi khuẩn
Các chủng vi khuẩn được định danh dựa trên đặc điểm hình thái và di truyền (dựa vào sự tương đồng trong trình tự 16S rRNA) thực hiện tại Công ty TNHH dịch vụ và thương mại Nam Khoa , TP. Hồ Chí Minh.
a. Đặc điểm về hình thái:
Quan sát đại thể trên mơi trường thạch đĩa NA để xác định hình thái khuẩn lạc, màu sắc khuẩn lạc. Quan sát vi thể sử dụng phương pháp nhuộm Gram, đây là phương pháp làm tiêu bản nhuộm màu phổ biến để theo dõi đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn.
b. Đặc điểm về di truyền (phân tích trình tự 16S rRNA)
- Tách chiết DNA: thu nhận DNA bộ gen của các chủng phân lập được.
- Sau đó, khuếch đại trình tự 16S rRNA bằng phản ứng PCR để có thể định danh một cách chính xác các chủng vi khuẩn. Các phản ứng PCR được thực hiện với các mồi NK28s-F và NK28s-R khếch đại được đoạn gene dài khoảng 500 bp chứa các trình tự giúp phân biệt giữa lồi vi khuẩn.
- Phân tích trình tự 16S rRNA: kết quả trình tự sẽ được xử lí bằng phần mềm fast PCR để tạo ra các trình tự rRNA nguyên vẹn của mỗi chủng vi khuẩn. Trình tự 16S rRNA nguyên vẹn này sẽ được so sánh với các trình tự gen của các chủng vi khuẩn khác trên ngân hàng dữ liệu NCBI (National Center for Biotechnology Information) bằng phần mềm BLAST SEARCH (Basic Local Alignment Search Tool).
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Đặc tính của một số loại bùn thải
Bảng 2: Đặc tính lý, hóa và sinh học của bùn thải ở 3 nhà máy
Stt Chỉ tiêu Đơn vị Kết quả NM giấy Bãi Bằng CTCP mía đường Hịa Bình NM tinh bột sắn FOCOCEV 1 Độ ẩm % 48,9 64,5 32,5 2 pH (KCl) 8,04 8,62 5,72 3 Tổng cacbon (TC) % 26,78 68,6 50,97 4 Tổng photpho (TP) % 1,28 2,66 0,41 5 Tổng kali dễ tiêu (K2O) % 0,16 0,37 0,07 6 Tổng nitơ (TN) % 3,85 1,96 1,02 7 Cu mg/k g 16,25 40 0,55 8 Ni mg/k g 12,86 20 0,22 9 Zn mg/k g 73,44 190 4,90 10 Pb mg/k g 22,11 18 2,46 11 Vi khuẩn tổng số CFU/ g 534 x 109 11 x 10 6 92,4 x 106
12 Nấm tổng số CFU/ g 346 x 105 75 x 10 4 56,4 x 106 13 Xạ khuẩn tổng số CFU/ g 467 x 106 9 x 10 4 85,6 x 106 14 E.coli O157:H7 CFU/ g MPN/g 2 400 0 15 Salmonella CFU/ g 0 0 0 16 Cryptosporidi um parvum Vi khuẩn/g 0 100 1800 tế bào/g 17 Giardia duodenalis Vi khuẩn/g 250 0 250 tế bào/g 18 Cyclospora spp. Vi khuẩn/g 300 100 0 19 Taenia saginata con/g 0 0 0
Nhận xét về đặc tính lý, hóa và vi sinh của bùn thải từ nhà máy giấy Bãi Bằng:
Công nghệ xử lý nước thải của nhà máy giấy Bãi Bằng dựa trên nguyên tắc sử dụng vi sinh vật hiếu khí để phân hủy các chất ô nhiễm hữu cơ trong nước thải và tạo nên sinh khối của chúng (bùn sinh học). Một phần bùn sinh học này được đưa trở lại bể hiếu khí, phần cịn lại được loại bỏ (bùn thải). Khi thải vào môi trường với một lượng lớn sẽ gây ô nhiễm môi trường và được xem là lãng phí tài ngun. Vì vậy, với mục đích tận dụng bùn thải từ hệ thống xử lý nước thải nhà máy giấy Bãi Bằng làm nguồn phân bón, các đặc tính của bùn thải đã được nghiên cứu. Kết quả được trình bày ở bảng 2.
Một độ ẩm ban đầu của nguyên liệu là 50-60% thường được xem là tối ưu cho ủ hiếu khí (composting) bởi nó cung cấp đủ nước để duy trì sự sinh trưởng, phát
triển của vi sinh vật nhưng cũng khơng q nhiều để ngăn chặn luồng khơng khí. Khi điều kiện trở nên khô hơn 35-40%, hoạt động của vi khuẩn bị ức chế. Trong khi độ ẩm trên 65% lại khiến cho quá trình phân hủy chậm, sinh mùi bởi điều kiện yếm khí và rửa trơi chất dinh dưỡng [1]. Trong nghiên cứu này, độ ẩm của mẫu bùn thải nhà máy giấy Bãi Bằng (48,9%) có thể được xem là thích hợp cho q trình ủ phân. Trong suốt q trình ủ hiếu khí, pH của đống ủ nói chung biến đổi trong khoảng 5,5 và 8,5 [1]. pH ban đầu của đống ủ phụ thuộc vào thành phần nguyên liệu. Trong giai đoạn đầu, các acid hữu cơ có thể tích lũy như là sản phẩm phụ của sự phân giải chất hữu cơ bởi vi khuẩn và nấm. Việc pH giảm sẽ khuyến khích sự phát triển của nấm để phân hủy lignin và cellulose. Thông thường, các acid hữu cơ tiếp tục bị phân hủy và pH tăng lên. Sau đó pH có khuynh hướng trở nên trung tính bởi vì khí amoniac hoặc bị mất vào trong khí quyển hoặc tham gia vào quá trình phát triển mới của vi khuẩn. Phân hữu cơ thành phẩm thường có pH 6- 8. Ở đây, bùn thải nhà máy giấy Bãi Bằng có pH kiềm (pH 8,04) do trong q trình hình thành bùn thải có chứa một lượng lớn CaCO3 (chất có trong hạt sơ sợi cellulose) và là thích hợp để được sử dụng làm nguyên liệu ban đầu cho q trình ủ hiếu khí sản xuất phân bón hữu cơ. Bên cạnh đó, trong số nhiều yếu tố cần thiết cho sự phân hủy của vi khuẩn, C và N là quan trọng nhất và là yếu tố hạn chế phổ biến nhất. Tỉ lệ C: N lý tưởng cho q trình ủ hiếu khí nói chung là khoảng 30: 1 (theo trọng lượng). Trong nghiên cứu này, bùn thải nhà máy giấy Bãi Bằng có tỉ lệ C: N là khoảng 7: 1, vì vậy nên phối trộn thêm nguồn C khác để đạt hiệu quả phân hủy cao. Ngoài ra, tất cả các dạng ủ hiếu khi sản xuất phân bón hữu cơ đều phụ thuộc vào hoạt động của vi khuẩn và nấm. Vi khuẩn chịu trách nhiệm cho hầu hết các quá trình phân hủy và sinh nhiệt trong đống ủ, xạ khuẩn đóng vai trị quan trọng trong việc phân hủy các phân tử hữu cơ phức tạp như cellulose, lignin, chitin và protein mà không được phân hủy bởi các dạng vi khuẩn khác và nấm. Trong khi đó, nấm bao gồm nấm mốc và nấm men lại chịu trách nhiệm phân hủy nhiều mạch thực vật phức tạp trong nguyên liệu đống ủ, đặc biệt chúng tấn công các bã thải hữu cơ rất khơ, có tính acid và hàm lượng N thấp cho sự phân hủy bởi vi khuẩn.
Theo phân tích, bùn thải nhà máy giấy Bãi Bằng cũng có chứa hàm lượng kim loại nặng, tuy nhiên đa số các thành phần kim loại nặng đều thấp hơn nhiều so với ngưỡng quy chuẩn cho phép theo QCVN 50:2013/BTNMT [2]. Ở đây mẫu bùn thải nghiên cứu có chứa một mật độ tương đối cao của các nhóm vi sinh vật ưa ấm và ưa nhiệt. Vì vậy sẽ là rất thuận lợi khi được sử dụng làm nguyên liệu cho quá trình ủ phân. Mặt khác, bùn thải nhà máy giấy Bãi Bằng cũng có chứa một hàm lượng kim loại nặng và một số vi sinh vật và ký sinh trùng gây bệnh.
Nhận xét đặc tính lý, hóa và sinh học của bùn thải từ CTCP mía đường Hịa Bình:
Qua bảng 2 cho thấy mẫu chất thải khá kiềm (pHKCl= 8,62) do trong quá trình lắng nhà máy đã bổ sung Ca(OH)2 để trung hịa axit. Trong khi pH thích hợp nhất để tiến hành ủ phân là 6 – 8. Vì thế nên giảm pH ban đầu của mẫu chất thải trước khi tiến hành ủ.
Ngoài ra, độ ẩm khơng khí, độ ẩm vật liệu hay độ ẩm môi trường cũng ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển và sinh sản của vi sinh vật. Đa số vi sinh vật phát triển tốt ở độ ẩm khơng khí 80% và độ ẩm mơi trường > 20%. Nếu hạ thấp độ ẩm sẽ làm rối loạn quá trình sinh lý bình thường của vi sinh vật. Độ ẩm là một trong những yếu tố làm cho vi sinh vật tiếp nhận thức ăn dễ dàng. Nhờ có độ ẩm tốt mà các chất dinh dưỡng dễ thâm nhập vào cơ thể, các hệ enzym thuỷ phân mới hoạt động được. Nếu độ ẩm quá thấp xảy ra hiện tượng thay đổi trạng thái của nguyên sinh chất. Mẫu chất thải có độ ẩm là 64,5% để làm nguyên liệu cho quá trình ủ compost mà độ ẩm cần thiết cho quá trình ủ vào khoảng 40 – 45%. Do đó trước khi ủ, ta cần điều chỉnh độ ẩm ban đầu của nguyên liệu chất thải để đảm bảo hiệu quả của quá trình ủ.
Kết quả nghiên cứu ở bảng trên cho thấy mẫu bùn thải có hàm lượng dinh dưỡng ở mức rất cao so với tiêu chuẩn của mẫu đất. Cụ thể, so với tiêu chuẩn của đất giàu dinh dưỡng hàm lượng:
- TP cao hơn gấp 26 lần, điều này có thể là do trong quy trình sản xuất tại khâu lọc bã mía được gia vơi sơ bộ bổ sung P2O5 bằng cách cho thêm H3PO4 khiến cho hàm lượng P trong mẫu cao.
- TK cao hơn gấp 4 lần.
Vì thế, với hàm lượng chất hữu cơ cao, bùn thải của nhà máy mía đường có thể là một nguồn nguyên liệu tiềm năng cho sản xuất phân hữu cơ sinh học chất lượng cao. Cũng dựa vào kết quả trên, sau q trình ủ phân, ta có thể phân tích lại các hàm lượng trên rồi bổ sung thêm các nguyên tố N,P, K theo tỷ lệ thích hợp làm phân bón cho từng loại đất.
Ngồi ra ta cũng quan tâm tới tỷ lệ C:N. Tỷ lệ C:N là hệ số dinh dưỡng chính. Trong thực tiễn sản xuất compost, tỷ lệ này vào khoảng 20:1 đến 25:1. Theo kinh nghiệm chung, nếu tỷ lệ C:N vượt quá giới hạn vừa nêu, tốc độ phân hủy sẽ bị chậm lại. Ngược lại, nếu tỷ lệ thấp hơn 20:1, N có khả năng bị thất thốt. Bởi vì, N dư chuyển hóa thành N trong NH3. Giai đoạn chuyển hóa trong sản xuất compost có đặc điểm pH và nhiệt độ khá cao, đặc điểm này có thể gây ra sự bay hơi của NH3. Nhưng kết quả của bảng phân tích cũng cho ta biết tỷ lệ C:N của mẫu chất thải hữu cơ là 35. Tỷ lệ này quá cao do đó trước khi ủ phân compost ta cần bổ sung thêm N để đưa về tỷ lệ 25:1 để quá trình ủ phân đạt hiệu quả tốt nhất.
Theo phân tích, bùn thải CTCP mía đường Hịa Bình cũng có chứa hàm lượng kim loại nặng, tuy nhiên đa số các thành phần kim loại nặng đều thấp hơn nhiều so với ngưỡng quy chuẩn cho phép theo QCVN 50:2013/BTNMT [2].
Qua bảng 2, chúng tôi nhận thấy rằng trong mẫu bùn thải có chứa một lượng lớn vi khuẩn E.coli- vi khuẩn gây tiêu chảy xuất huyết đường ruột. Đặc biệt trong mẫu chất thải cịn có ký sinh trùng là các đơn bào Cryptosporidium
parvum, Cyclosporasp. Các mầm mống trên đều dễ gây bệnh qua đường ăn uống
mà mắt thường ta khơng nhìn thấy được do đó cần phải có các biện pháp xử lý các mầm mống kịp thời trước hoặc trong quá trình ủ phân vi sinh.Tuy nhiên tác nhân gây bệnh có thể bị tiêu diệt do nhiệt được tạo ra trong suốt pha ưa nhiệt (Wong và cs., 1995; Furkacker và Haberl, 1995; Finstein và cs., 1980). Hơn thế nữa, phân
compost chín cũng chứa các hóa chất hữu cơ tự nhiên và vi sinh vật hữu ích có khả năng tiêu diệt hoặc ức chế các vi sinh vật gây bệnh (EPA, 1998).
Nhận xét đặc tính lý, hóa và sinh học của bùn thải từ nhà máy tinh bột sắn Fococev Thừa Thiên Huế:
Phân hữu cơ thành phẩm nói chung có pH trong khoảng 6 - 8. Vì thế pH của nguyên liệu ủ ban đầu có ảnh hưởng đáng kể đến hoạt động của hệ vi sinh vật trong q trình ủ hiếu khí. Đối với vi sinh vật, pH ảnh hưởng tới tính thấm của màng, hoạt động chuyển hóa vật chất, hoạt tính enzym và sự hình thành ATP của vi sinh vật. Vi khuẩn phát triển thuận lợi nhất trong môi trường trung tính hoặc kiềm yếu. Do đó ta cần xác định pH của mẫu chất thải để điều chỉnh pH tạo điều kiện vi sinh vật ưa nhiệt phát triển tối ưu nhất. Tuy nhiên, bùn thải nhà máy FOCOCEV Thừa Thiên Huế có pH khá thấp (pH 5,72) vì do quá trình lên men tinh bột cũng như các protein thực vật trong quá trình sản xuất, vì vậy nên điều chỉnh pH của nguyên liệu ban đầu đến mức thích hợp khi ủ hiếu khí sản xuất phân bón hữu cơ. Độ ẩm là một yếu tố cần thiết cho hoạt động của vi sinh vật trong quá trình chế biến phân hữu cơ. Trong phân tích này, tại thời điểm lấy mẫu độ ẩm của mẫu bùn thải nhà máy FOCOCEV Thừa Thiên Huế (32,5%) là khá thấp, vì vậy cần thiết phải bổ sung thêm nước vào nguyên liệu cho q trình ủ hiếu khí khi sản xuất phân bón hữu cơ.
Tỷ lệ C:N tối ưu cho quá trình ủ phân là khoảng 30:1. Trong phân tích này, tại thời điểm lấy mẫu bùn thải nhà máy FOCOCEV Thừa Thiên Huế có tỉ lệ C:N là 50:1, vì vậy cần thiết phải phối trộn với một hoặc một số nguồn N khác để đảm bảo hiệu quả phân giải nguyên liệu cao cho quá trình ủ hiếu khí. Tỉ lệ C:N là thơng số quan trọng nhất, P là nguyên tố quan trọng kế tiếp; S, Ca và các nguyên tố vi lượng khác cũng đóng vai trị quan trọng trong trao đổi chất của tế bào. Cung cấp đủ P, K và các chất vô cơ khác như Ca, Fe, Bo, Cu,... là cần thiết cho sự chuyển hóa của vi