Dòng EOF di chuyển từ cực dƣơng sang cực âm, dƣới tác dụng của điện trƣờng, các cation di chuyển cùng chiều với dịng EOF do đó di chuyển nhanh hơn, ngƣợc lại các anion di chuyển ngƣợc chiều với dịng EOF do đó di chuyển chậm hơn còn các phần tử trung hịa khơng chịu tác động của điện trƣờng nên di chuyển cùng tốc độ với dịng EOF.
Hình 1.4. Ảnh hưởng của dịng EOF đến tốc độ của các ion trong quá trình điện di
Do vậy, để có đƣợc hiệu quả tách cao cần tìm đƣợc dịng EOF có cƣờng độ phù hợp với chất phân tích, có nghĩa là phải tối ƣu hóa các điều kiện của q trình điện di.
Dung dịch đệm pH và pha động trong phƣơng pháp điện di mao quản
Dung dịch đệm quyết định độ linh động điện di của các chất phân tích. Do yếu tố pH, loại dung dịch đệm mà trong đó, các ion và phân tử axit hay bazơ trong thành phần của dung dịch đệm góp phần tạo nên lực ion của chúng. Hơn nữa, chúng cũng ảnh hƣởng đến độ tan, tốc độ phản ứng của các chất [6, 14, 24].
Bảng 1.6. Các chất thường dung làm pha động trong CE và giá trị pK của chúng
Tên chất Gía trị pKi Tên chất Gía trị pKi
Format 3,75 Trixin 8,05 Axetat 4,76 Bixin 8,25 Xitrat 3,12; 4,76; 6,40 Tris 8,30 MES 6,13 TAPS 8,40 ACES 6,75 Borat 9,14 MOPSO 6,79 CHES 9,55 BES 7,16 CAPS 10,40 MOPS 7,20 Phophat 2,14; 7,10; 8,97 DIPSO 7,50 Histidin 1,78; 5,97; 8,97 HEPES 7,51 Lysin 2,20; 8,90; 10,28 HEPPSO 7,90 Arginin 2,18; 9,09; 13,20
Nguồn điện thế cao
Quá trình điện di trong mao quản chỉ xảy ra khi có nguồn thế V một chiều nhất định đặt vào hai đầu mao quản. Thế V này tạo ra lực điện trƣờng E và dòng điện I trong mao quản, nó điều khiển và duy trì sự điện di của các chất. Việc chọn điện thế V là bao nhiêu tùy thuộc vào bản chất của chất phân tích, chất nền của mẫu, giá trị pH của pha động điện di…[6, 14, 24]
Kỹ thuật bơm mẫu trong phƣơng pháp điện di mao quản
Trong điện di mao quản có ba phƣơng pháp thƣờng dùng nạp mẫu phân tích vào trong mao quản, bao gồm[6, 14, 24]:
- Phƣơng pháp thủy động lực học dùng áp suất - Phƣơng pháp thủy động lực học theo kiểu xiphông - Phƣơng pháp điện động học
18
Hình 1.5. Các kĩ thuật bơm mẫu trong phương pháp điện di mao quản
Kĩ thuật bơm mẫu kiểu thuỷ động học
Trong kĩ thuật này, mẫu đƣợc bơm vào mao quản nhờ áp lực (hình 1.5 A, B). Khi đó, lƣợng mẫu bơm vào trong mao quản phụ thuộc vào áp lực sử dụng (áp suất, lực hút chân không hoặc chiều cao bơm mẫu) và thời gian bơm mẫu.
Kĩ thuật bơm mẫu kiểu điện động học
Kĩ thuật này sử dụng lực điện khi áp thế cao (5 - 10 kV trong vài giây) để bơm mẫu vào mao quản (Hình 1.5 C). Phƣơng pháp bơm mẫu này cho kết quả các pic phân tách có độ sắc nét cao. Tuy nhiên phƣơng pháp này có nhƣợc điểm rất lớn là diện tích pic (dùng để định lƣợng) có độ lặp lại thấp với các nền mẫu khác nhau, do đó thƣờng chỉ dùng để định tính.
Phương pháp điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc CE-C4D
Trong phƣơng pháp điện di mao quản, detector đo độ dẫn là một trong những loại detector rất đƣợc chú ý, tuy có độ nhạy thấp hơn so với hai kĩ thuật điện hóa khác nhƣng lại có ƣu điểm là detector đa năng có thể dùng cho rất nhiều loại chất phân tích khác nhau. Detector này có thể thu nhỏ, thuận lợi khi kết hợp với các mao quản có đƣờng kính hẹp, thậm chí với các microchip mà khơng ảnh hƣởng đến độ nhạy và các
tính chất khác của detector[6, 14, 24].
Giới thiệu chung
Cảm biến đo độ dẫn không tiếp xúc (C4D) với thiết kế hai điện cực đồng trục xuất hiện lần đầu trên thế giới vào năm 1998. Dựa trên thiết kế này, năm 2002 nhóm nghiên cứu của GS Peter Hauser (khoa Hóa, trƣờng đại học Basel, Thụy Sỹ) đã phát triển thành cơng dịng sản phẩm C4
D với nguồn điện thế kích thích xoay chiều cao (HV- C4D, 200V). Hãng điện tử eDAQ của Úc sau đó đã phối hợp cùng nhóm nghiên cứu của GS. Peter Hauser để phát triển dòng sản phẩm C4D thƣơng phẩm dựa trên nghiên cứu này.
Nguyên lý hoạt động C4D
Nguyên lý hoạt động của C4D đƣợc minh họa trong hình 1.6
Hình 1.6. Nguyên lý hoạt động của cảm biến đo độ dẫn không tiếp xúc
Nguồn điện xoay chiều (V) với tần số (f) đƣợc áp vào điện cực thứ nhất. Tại điện cực thứ hai, tín hiệu đo đƣợc ở dạng cƣờng độ dịng điện (I). Theo đó, dịng điện thu đƣợc tại điện cực thứ 2 sẽ phụ thuộc vào độ lớn của điện thế V và tần số f.
Tín hiệu đầu ra thu đƣợc ở dạng cƣờng độ dòng điện (xoay chiều), sau đó sẽ đƣợc chuyển đổi và khuếch đại thành tín hiệu dạng vơn thế (xoay chiều), thông qua
20
việc sử dụng một điện trở khuếch đại (Rfeedback). Vôn thế xoay chiều sau đó đƣợc chuyển đổi thành vơn thế 1 chiều, lọc nhiễu và khuếch đại, sau cùng chuyển đổi thành tín hiệu số hóa trƣớc khi đƣợc hiển thị và lƣu trữ trên máy tính.
Nhƣ vậy, detector đo độ dẫn khơng tiếp xúc ngồi ƣu điểm là phân tích đa năng cịn có ƣu điểm là khơng nhất thiết phải có sự tiếp xúc trực tiếp của các điện cực với dung dịch đo nhờ lợi dụng tính chất kết nối tụ điện với dung dịch bên trong mao quản hoặc ống phản ứng. Đây là một cách rất thông minh loại trừ ảnh hƣởng của điện thế cao trong quá trình phân tách điện di đến hệ điện tử của detector và không làm nhiễm bẩn dung dịch phân tích.
1.4. Một số kỹ thuật làm giàu trực tiếp trên cột trong phƣơng pháp điện di mao quản quản
Giới hạn phát hiện ( LOD) của phƣơng pháp điện di mao quản còn hạn chế bởi kích thƣớc mao quản. Ví dụ, lƣợng mẫu đƣợc bơm vào mao quản bị hạn chế bởi thể tích mao quản nhỏ. Hơn nữa, chiều dài giảm gây hạn chế giới hạn phát hiện của phƣơng pháp. Nhiều kỹ thuật đƣợc phát triển nhằm cải thiện LOD của phƣơng pháp điện di mao quản. Làm giàu trực tiếp trên cột (làm giàu “online” ) là một trong những hƣớng phát triển của phƣơng pháp điện di mao quản. Việc lựa chọn một nền mẫu thích hợp có thể cải thiện giới hạn phát hiện và hiệu quả tách chất. Nhìn chung các kỹ thuật này đƣợc thiết kế nhằm “tập trung” vùng mẫu chứa chất phân tích trong mao quản, do đó làm tăng thể tích mẫu đƣợc bơm vào mao quản trong CE. Các kỹ thuật làm giàu trực tiếp trên cột mao quản đƣợc nghiên cứu nhƣ: làm giàu dựa trên sự khác biệt về độ dẫn của chất phân tích tại ranh giới giữa hai vùng đệm khác nhau về điện trở hay sự phân bố chất phân tích giữa hai vùng ổn định và vùng ổn định tạm thời (pseudostationary phase). Một số kỹ thuật làm giàu trực tiếp trên cột mao quản đƣợc phát triển và áp dụng khá hiệu quả nhƣ khuếch đại vùng mẫu, tăng thể tích mẫu bơm vào mao quản, khuếch đại mẫu trong hệ đệm liên tục và kỹ thuật làm giàu đẳng điện.
Hệ số làm giàu đối với As(III) là tỷ lệ chiều cao pic As(III) trong nền mẫu là axit với chiều cao pic As(III) trong nƣớc với cùng một nồng độ.
Hệ số làm giàu đối với As(III) đƣợc tính nhƣ sau: k= a/ b
Trong đó:
k: hệ số làm giàu
a: Tín hiệu As(III) pha trong mơi trƣờng axit b: Tín hiệu As(III) pha trong nƣớc
1.4.1. Kỹ thuật khuếch đại điện trường
Kỹ thuật làm giàu trên cơ sở tăng lƣợng mẫu bơm vào mao quản đơn giản nhất là khuếch đại điện trƣờng (Field- amplified sample stacking- FASS). Nguyên tắc chung của kỹ thuật này là sự di chuyển điện hóa chậm của các ion chất phân tích trong vùng ranh giới đƣợc hình thành giữa hai vùng đệm, một dung dịch có độ dẫn thấp vào một dung dịch có độ dẫn cao. Ví dụ, chất phân tích đƣợc hịa tan trong dung dịch có độ dẫn thấp nhƣ nƣớc. Lực điện trƣờng tác động lên vùng mẫu có có độ dẫn điện thấp sẽ cao hơn so với vùng dung dịch đệm điện di có độ dẫn cao hơn. Do đó, chất phân tích di chuyển nhanh trong vùng mẫu tới bề mặt vùng ranh giới giữa hai vùng đệm. Khi các ion chất phân tích vào vùng đệm điện di có độ dẫn cao hơn, chúng di chuyển chậm hơn, hình thành các dải hẹp của chất phân tích [2, 20, 26, 36], từ đó tập trung đƣợc vùng mẫu, làm giàu chất phân tích ngay trên cột tách của phƣơng pháp điện di mao quản.
Hình 1.7 : Cơ chế của kỹ thuật làm giàu khuyếch đại điện trường
1.4.2. Kỹ thuật bơm mẫu lượng lớn
Kỹ thuật bơm mẫu lƣợng lớn (large volume sample satcking- LVSS) là một kỹ thuật đƣợc đề xuất bởi Chien và Burgi [20, 26, 36], chất phân tích đƣợc hịa tan trong
Comment [TA5]: Tín hiệu?
22
nƣớc và bơm mẫu thủy động lực học sao cho lƣợng mẫu chiếm 1/3 đến 1/2 thể tích mao quản. Tiến hành phân cực ngƣợc với dung dịch đệm diện di đƣợc đặt phía cuối mao quản tại vị trí của detector. Kết quả, dịng EOF ngƣợc hƣớng với chất phân tích ở dạng anion (chất phân tích di chuyển về phía detector) và hiệu ứng làm giàu đạt đƣợc tại bề mặt ranh giới tiếp xúc với vùng đệm điện di. Dòng điện di sẽ đƣợc kiểm soát đến khi đạt 90- 99% giá trị thơng thƣờng. Ngay sau đó, tiến hành điện di bình thƣờng và quá trình tách chất xảy ra. Với kiểu phân cực ngƣợc có thể loại bỏ đƣợc các cation và các phần tử không mang điện sẽ bị loại khỏi mao quản trƣớc khi quá trình điện di đƣợc tiến hành lại bình thƣờng. Tuy nhiên, một số anion chất phân tích cũng sẽ bị loại bỏ nếu dịng điện di khơng đƣợc kiểm soát chặt chẽ. Kỹ thuật này không phân tách đồng thời các anion và cation và khơng áp dụng hiệu quả với chất phân tích có độ linh động điện di thấp. Dịng điện di thẩm thấu cần đƣợc kiểm sốt chặt chẽ để thu đƣợc độ lặp lại tốt. CTAB đƣợc thêm vào dung dịch đệm điện di cũng là một cách hiệu quả để cải biến dịng EOF, q trình thực hiện đƣợc minh họa trên hình 1.8.
Hình 1.8: Cơ chế của kỹ thuật làm giàu bơm mẫu lượng lớn
1.4.3. Kỹ thuật làm giàu mẫu bằng pH (pH- Mediated stacking)
Cả hai phƣơng pháp làm giàu mẫu FASS và LVSS dều đƣợc tiến hành khi mẫu đƣợc hòa tan trong nƣớc hay mẫu đƣợc hịa tan trong đệm có độ dẫn thấp. Với phƣơng pháp làm giàu mẫu trên cơ sở chênh lệch về độ pH có thể cải thiện giới hạn phát hiện của phƣơng pháp điện di ngay cả khi dung dịch mẫu có độ dẫn cao. Chất phân tích
đƣợc hịa tan trong nền mẫu có lực ion lớn, đƣợc bơm vào mao quản bằng phƣơng pháp điện động học. Do điện trở của nền mẫu thấp hơn so với điện trở của dung dịch đệm điện di nên điện trƣờng tác dụng chủ yếu lên vùng đệm điện di [20, 26, 36]. Nguyên tắc của kỹ thuật này đƣợc minh họa trong hình 1.9.
Hình 1.9: Cơ chế của kỹ thuật làm giàu trên cơ sở sự chênh lệch về độ pH
1.4.4. Kỹ thuật làm giàu đẳng điện
Phƣơng pháp làm giàu đẳng điện (ITP - isotachophoresis) đƣợc thực hiện với một hệ đệm “không liên tục”. Phƣơng pháp ITP đƣợc áp dụng với nhiều chất phân tích từ kích thƣớc nhỏ nhỏ đến kích thƣớc cồng kềnh nhƣ protein. Kỹ thuật này đặc biệt hữu ích ngay cả khi mẫu khơng hịa tan trong nƣớc nhƣng tồn tại các ion dẫn, ví dụ các mẫu sinh học. Với ITP, mẫu đƣợc đặt giữa hai vùng đệm, dung dịch đệm điện di với độ linh động điện di cao có vai trị nhƣ chất điện phân dẫn “leading electrolyte” và dung dịch đệm điện di có độ linh động thấp hơn có vai trị là chất điện phân cuối “terminating electrolyte”. ITP đƣợc áp dụng với cả cation và anion. Khi phân tách cation, bình đệm chứa chất điện phân dẫn đƣợc đặt tại catot và bình chất điện phân cuối đƣợc đặt ở cực còn lại ngay khi bơm mẫu. Khi áp thế sẽ hình thành các vùng mẫu của các chất phân tích có cùng tốc độ điện di và quá trình phân tách đƣợc thực hiện (hình 1.10)[20, 24, 26, 36].
24
Hình 1.10: Cơ chế của kỹ thuật làm giàu đẳng điện ITP
1.4.5. Kỹ thuật làm giàu sử dụng sự khác biệt về pH giữa hai vùng mẫu (Dynamic pH junction) pH junction)
pH của dung dịch đệm điện di có vai trị quan trọng tác động tới khả năng tách chất trong điện di. Giá trị pH đƣợc lựa chọn sao cho gần với giá trị pKa của các chất phân tích. Kỹ thuật làm giàu Dynamic pH junction là kỹ thuật làm giàu dựa trên sự thay đổi trạng thái ion hóa hay độ dẫn của chất phân tích giữa các vùng pH khác nhau. Kỹ thuật này có khả năng làm giàu các chất phân tích có khoảng pKa nhỏ và phƣơng pháp này rất hiệu quả với chất phân tích là các axit yếu và bazơ yếu [18, 20, 23, 24, 26, 36].
Hình 1.11: Cơ chế của kỹ thuật làm giàu dựa trên sự khác nhau giữa pH của vùng đệm điện di và mẫu phân tích
Trong số các kỹ thuật làm giàu mẫu trực tiếp trên cột của phƣơng pháp điện di mao quản, các kỹ thuật bơm mẫu lƣợng lớn, kỹ thuật làm giàu đẳng điện và kỹ thuật làm giàu mẫu bằng pH đều không hiệu quả trong quá trình làm giàu phân tích hàm lƣợng As(III). Lý do là một trong số các kỹ thuật này cần có q trình chuyển phân cực (nhƣ kỹ thuật bơm mẫu lƣợng lớn) rất khó thực hiện để đạt đƣợc độ lặp lại tốt đối với mẫu phân tích và đặc biệt càng khó tiến hành lặp lại tốt đối với các mẫu nƣớc ngầm khác nhau có thành phần khác nhau. Việc chuyển phân cực trong bƣớc làm giàu cịn khó tiến hành với thiết bị điện di mao quản dùng để thực hiện đề tài này vì thiết bị sử dụng chỉ áp thế 1 chiều. Hơn nữa, một số phƣơng pháp làm giàu trên còn sử dụng một số chất có độ dẫn cao thêm vào dung dịch đệm điện di (nhƣ kỹ thuật làm giàu đẳng điện) hoặc chất có độ dẫn cao đƣợc thêm vào dung dịch nền mẫu có khả năng gây ra nhiễu nền lớn; điều này ảnh hƣởng rất lớn tới q trình phân tích cũng nhƣ tín hiệu As(III)- chất có độ linh động điện di rất kém. Trong khi đó, kỹ thuật làm giàu sử dụng sự khác biệt về pH giữa hai vùng mẫu (dynamic pH junction) tỏ ra ƣu thế và dễ áp dụng trong q trình làm giàu As(III). Do đó, chúng tơi lựa chọn kỹ thuật này nhằm làm tăng độ nhạy xác định dạng As(III) trong mẫu nƣớc bằng phƣơng pháp điện di mao quản. Dạng As(V) sẽ đƣợc xác định gián tiếp qua dạng As(III).
Kỹ thuật làm giàu sử dụng sự khác biệt về pH giữa hai vùng mẫu (dynamic pH junction) trong phân tích As(III) bằng CE- C4D kiểu phân cực ngƣợc
Do axit aseno có pKa= 9,2 nên trong vùng đệm có pH ≥ 9, As(III) tồn tại chủ yếu dƣới dạng anion H2AsO3-
có độ linh động điện di kém nên khi tiến hành điện di thông thƣờng (áp thế âm ở đầu bơm mẫu) thì thời gian di chuyển điện di của As(III) hầu nhƣ chậm nhất trong số các anion khác có mặt trong mẫu và chỉ xuất hiện ngay trƣớc dịng EOF. Từ đó, nếu ta tiến hành phân cực ngƣợc (áp thế dƣơng ở đầu bơm mẫu) thì thứ tự điện di lần lƣợt sẽ là: các cation, dòng EOF và anion H2AsO3- xuất hiện trƣớc so với các anion khác có trong mẫu. Do đó, ta có thể tăng thời gain bơm mẫu cũng nhƣ áp dụng một số kỹ thuật làm giàu mẫu mà không bị ảnh hƣởng bởi các anion có hàm lƣợng rất cao có trong mẫu nƣớc ngầm.
26
Kỹ thuật làm giàu As(III) sử dụng sự khác biệt về pH giữa hai vùng mẫu (dynamic pH junction) đƣợc tiến hành As(III) đƣợc pha trong nền mẫu axit có pH thấp và pha động điện di có pH cao. Trong mơi trƣờng axit có pH thấp, As(III) tồn tại dƣới dạng phân tử trung hịa nên khơng bị điện di; khi tiến hành phân cực ngƣợc (áp thế dƣơng vào đầu bơm mẫu) dƣới tác dụng của dòng EOF các phân tử này sẽ bị kéo tới vùng ranh giới giữa hai vùng (vùng mẫu và vùng đệm). Tại đây, có sự thay đổi trạng thái oxi hóa của As(III) từ trạng thái phân tử trung hòa sang dạng anion H2AsO3-