CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN
1.3. Công dụng và các hoạt chất sinh học của Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm)
1.3.4. Phân lập và chuyển hóa Zerumbone
1.3.4.1. Phân lập Zerumbone
Nhƣ trên đã trình bày, Zerumbone là một chất có nhiều hoạt tính sinh học quý giá. Hơn nữa, nguyên liệu của nó cực kỳ phong phú nên ngƣời ta rất quan tâm phân lập Zerumbone để nghiên cứu làm dƣợc liệu.
Zerumbone có trong nhiều lồi thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) nhƣ Gừng tía (Zingiber purpureum Roscoe), nghệ đen (Curcuma Zerumbone zerdoaria)… nhƣng hàm lƣợng Zerumbone trong củ Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm) là cao nhất[5]. Vì vậy, ngƣời ta nghiên cứu phân lập Zerumbone chủ yếu từ củ Gừng gió.
Cho đến nay, có 2 phƣơng pháp phân lập Zerumbone từ củ Gừng gió.
i. Phƣơng pháp chiết:
Theo phƣơng pháp này, ngƣời ta chiết bột khô hay tƣơi nghiền từ củ Gừng gió bằng các dung mơi khác nhau nhƣ MeOH, EtOH, dietyl ete… sau đó xử lý và chiết các chất không phân cực bằng n-hexan, loại n-hexan rồi cho sản phẩm qua cột silica gel để phân lập Zerumbone [14]. Theo cách này Abdul và cộng sự trong bằng phát minh của mình cơng bố tháng 12 năm 2009 đã phân lập Zerumbone từ củ Gừng gió đạt hiệu suất 0,062% tính theo trọng lƣợng tƣơi.
ii. Phân lập Zerumbone từ tinh dầu
Theo cách này, ngƣời ta điều chế tinh dầu Gừng gió bằng phƣơng pháp cất hơi nƣớc trong một thiết bị đặc biệt, sau đó làm lạnh tinh dầu để thu đƣợc Zerumbone kết tinh, lọc tinh thể Zerumbone thô rồi tinh chế qua cột Silica gel thu Zerumbone tinh khiết.
Cũng theo phƣơng pháp này, Văn Ngọc Hƣớng và cộng sự đã phân lập thành công Zerumbone từ củ Gừng gió vùng Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc, Việt Nam đạt hiệu suất cao [11].
iii. Xác định cấu trúc phân tử của Zerumbone
Zerumbone là dẫn xuất của sesquitecpen có khung cacbon cơ sở là Humulan nên cịn có tên là 2,6,9-Humulatrien 8-one. Nó đƣợc Dev .S phân lập đầu tiên vào năm 1960 [20] từ củ Gừng gió Zingiber zerumbet Sm và một số loại Gừng
(Zingiber) khác. Nó kết tinh hình kim, nóng chảy 66-67oC, nhiệt độ sôi 165- 167oC/10mmHg, có cơng thức phân tử là C15H22O, phân tử lƣợng 218,33.
Cấu trúc tinh thể của Zerumbone đƣợc Sal S.R xác định năm 1981 [34]. Công thức cấu tạo phân tử Zerumbone đƣợc Dai J.R.et al xác định năm 1997 [19]. Kết quả xác định cấu trúc phân tử Zerumbone cho thấy nó có tên hóa học là (2E,6E,10E)-2,6,9,9-tetramethylcycloundeca-2,6,10-trien-1-one. Hóa lập thể của Zerumbone cũng đƣợc N.P. Damodaran và Sukh Dew xác định năm 1965 [31].
1.3.4.2. Các chuyển hóa Zerumbone
Zerumbone là một Sesquitecpen xeton đơn vịng có 03 liên kết đơi và nhóm xeton , khơng no. Cấu trúc phân tử của Zerumbone tạo cho nó có nhiều khả năng chuyển hóa lý thú. Đó là chuyển hóa liên kết đơi độc lập, chuyển hóa các liên kết đơi liên hợp với nhóm cacbonyl, chuyển hóa nhóm cacbonyl, và chuyển hóa mở vịng… Hơn nữa, nguồn nguyên liệu Zerumbone phong phú, chiếm 55-85% tinh dầu củ Gừng gió (Zingiber zerumbet. Sm).
Zerumbone là một chất có hoạt tính chống ung thƣ mạnh, chống viêm và HIV, do đó chuyển hóa Zerumbone cịn nhằm tạo ra các sản phẩm có hoạt tính sinh học tốt hơn zerumbone và tìm ra nhóm chức sinh học của phân tử zerumbone cũng là một hƣớng chuyển hóa làm cho các nhà khoa học thế giới rất quan tâm, đặc biệt là các nhà khoa học Nhật Bản.
b1. Chuyển hóa liên kết đơi liên hợp với nhóm cacbonyl
Năm 1999, Kitayma T. và cộng sự đã thực hiện phản ứng cộng hợp 1, 2 ở các liên đôi C6 và C9 với HCN, kết quả là vòng Zerumbone bị xoắn lại và tạo ra các đồng phân DIA có cấu hình thú vị, khi thực hiện cộng hợp 1 mol Brom vào liên kết đôi C6 tạo ra một hỗn hợp 2 đồng phân DIA 5A và 5B. Xử lý 5A với KCN cho ta hỗn hợp Cyclopropanecacboxylic acid 6A và 6B. Lập thể cũng nhƣ sự chọn lọc của các phản ứng này đều đã đƣợc khảo sát [37].
Các tác giả này cũng là những ngƣời đầu tiên nghiên cứu hóa học Zerumbone. Họ thực hiện phản ứng cộng hợp vào liên kết đơi liên hợp với nhóm cacbonyl và tạo ra liên kết vòng mới [37].
Phản ứng cộng hợp NH3 và dẫn xuất của nó vào liên kết đơi liên hợp với nhóm cacbonyl trong phân tử Zerumbone khơng những là phản ứng cộng hợp hay về lý thuyết mà sản phẩm tạo ra cũng có hoạt tính sinh học lý thú [40].
b2. Chuyển hóa liên kết đơi độc lập (C6 =C7)
Đặc trƣng nổi bật của liên kết đơi là dễ bị oxy hóa. Phản ứng quan trọng là epoxi hóa. Sản phẩm này là nguyên liệu cho chuyển hóa tiếp theo [37] thành những chất chống ung thƣ mật [42].
b3. Khử hóa nhóm cacbonyl
Tùy theo tác nhân khử mà nhóm cacbonyl của Zerumbone có thể khử về nhóm cacbinol hay nhóm metylen. Nhƣng nhƣ trên đã trình bày, Humulene khơng phải là chất có hoạt tính sinh học lý thú nên ngƣời ta thƣờng khử hóa nhóm cacbonyl của Zerumbone về nhóm cacbinol, sau đó chuyển hóa tiếp. Theo cách
này, Takashi Kitayama và cộng sự đã chuyển nhóm C=O về nhóm CHOH bằng Liti nhơm hidrua, sau đó este hóa [39].
Các tác giả trên cịn epoxi Zerumbone ở các liên kết đơi, với nhóm cacbinol để tạo ra dẫn xuất mới [39].
b4. Oxi hóa mở vịng Zerumbone để tạo ra các tác nhân mới ức chế MRSA (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus) và VRE (Vancomycin-resistant
Enterococcus).
Dƣới tác dụng của Brom trong CCl4 ở nhiệt độ từ -5oC đến -10oC, Zerumbone bị oxi hóa mở vịng ở liên kết đôi C1 = C2 tạo ra dẫn xuất Brom axit cacboxylic[40].
Sự trình bày trên cho thấy hóa học Zerumbone rất phong phú, khả năng chuyển hóa Zerumbone cịn nhiều, hơn nữa Zerumbone là nguồn nguyên liệu lớn ở nƣớc ta nên có thể nói đây là một hƣớng mới cho tổng hợp hữu cơ nhằm tạo ra các chất có hoạt tính sinh học q giá.
CHƢƠNG 2
ĐỀ TÀI, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM
2.1. Đề tài, mục tiêu, nội dung 2.1.1. Đề tài 2.1.1. Đề tài
Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm) là cây thuốc dân tộc, mọc hoang và phổ biến ở nƣớc ta. Nhƣ trong tổng quan đã trình bày, trong 20 năm trở lại đây các kết quả nghiên cứu của trong và ngồi nƣớc về hoạt tính chống ung thƣ của Zerumbone đã khẳng định rằng: Zerumbone là một tác nhân chống ung thƣ mạnh, nó ức chế sự phát triển của 10 loại ung thƣ khác nhau. Cơ chế chống ung thƣ của Zerumbone đã đƣợc chứng minh rõ ràng, nó thúc đẩy q trình tự chết (apoptosis) của tế bào ung thƣ làm cho ung thƣ khơng phát triển đƣợc, nó ức chế NF- kB hoạt động nên ngăn ngừa sự tạo thành ung thƣ và phát triển ung thƣ. Zerumbone lại không độc, nguyên liệu cho điều chế zerumbone là cây gừng gió (Zingiber zerumbet Sm)- nƣớc ta lại có nhiều và chất lƣợng tốt, hơn nữa gần đây ngƣời ta phát hiện ra rằng một số dẫn xuất của zerumbone có hoạt tính chống ung thƣ túi mật mạnh hơn zerumbone nhiều. Chính vì vậy mà điều chế Zerumbone có chất lƣợng cao để tổng hợp các dẫn xuất của zerumbone có hoạt tính sinh học là mục tiêu và nội dung của đề tài này.
2.1.2. Mục tiêu của đề tài
a. Nghiên cứu các phƣơng pháp phân lập zerumbone có chất lƣợng cao từ thân rễ cây gừng gió.
b. Chuyển hóa zerumbone thành các hợp chất có hoạt tính sinh học và xác định cấu trúc phân tử của chúng bằng các phƣơng pháp quang phổ hiện đại.
c. Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của các sản phẩm tổng hợp đƣợc từ zerumbone.
2.1.3. Nhiệm vụ của đề tài
a. Nghiên cứu qui trình điều chế zerumbone có chất lƣợng cao ( 99%) từ củ gừng gió.
b. Tổng hợp một số dẫn xuất của zerumbone và khảo sát hoạt tính chống ung thƣ của chúng.
2.2. Các phƣơng tiện nghiên cứu 2.2.1. Thiết bị nghiên cứu
- Sắc kí lớp mỏng: dùng bản mỏng tráng sẵn của MERCK: 60 F254. - GC-MS đo bằng máy GC-6890 MS-5973.
- Phổ hồng ngoại (IR) ghi trên máy impact 410 –Nicolet 760 FT-IR (theo phƣơng pháp ép viên KBr).
- Phổ tử ngoại (UV) đo trên máy GBC 2855.
- Phổ khối lƣợng (MS) ghi trên máy Hewlett Packard HP5890, Serie II. - Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR): 1H-NMR, 13C-NMR, 13C-NMR- DEPT-135, 13C-NMR-DEPT-90, COSY, HMQC, HMBC, đƣợc ghi trên máy Brucker Advance-500 MHz, chuẩn nội TMS (tetrametyl silan), độ chuyển dịch hóa học (δ) đƣợc biểu thị bằng ppm, hằng số J tính theo Hz.
. Các phổ đƣợc thực hiện tại Viện hóa học, Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2.2. Các hóa chất
Các dung mơi, thuốc thử và các hóa chất khác đều dùng của hãng MERCK hay của Trung Quốc loại tinh khiết (PA). Nếu là dung mơi cơng nghiệp thì phải xử lý nhƣ sau:
- Dung môi etylaxetat kỹ thuật đƣợc rửa axit 3 lần với dung dịch Na2CO3 5%, sau đó đƣợc rửa bằng nƣớc cất đến pH = 7. Làm khô bằng Na2SO4 khan, CaSO4 khan, cất lấy etylaxetat ở phân đoạn có nhiệt độ sơi 76-780C.
- Dung môi n-hexan kỹ thuật đƣợc rửa bằng axit H2SO4 đậm đặc, sau đó bằng nƣớc cất đến pH= 7, làm khô bằng Na2SO4 khan và cất lấy ở phân đoạn có nhiệt độ sơi 67-680C.
Sắc kí lớp mỏng (SKLM) đƣợc chạy trên những bản nhôm tráng sẵn silica gel 60F254 độ dày 0,2mm của hãng Merck.
Các sắc kí đồ lớp mỏng nhận biết bằng thuốc thử vanillin/H2SO4 1% (dùng để nhận biết các nhóm chất nhƣ steroit, tecpenoit, các chất màu, chất sáp…). Thuốc thử đƣợc điều chế nhƣ sau: cho 0,2g vanillin vào 10ml H2SO4 đặc 98% khuấy đến tan hết, thu đƣợc dung dịch thuốc thử.
Chất hấp phụ dùng trong q trình sắc kí cột là silica gel cỡ hạt 0,040-0,063 mm của hãng Merck.
2.3. Thực nghiệm
2.3.1. Nghiên cứu các phƣơng pháp phân lập zerumbone từ thân rễ cây gừng gió gió
2.3.1.1. Nguyên liệu và phƣơng pháp xử lý
Mẫu thực vật đƣợc lấy ở vùng Tam Đảo tỉnh Vĩnh Phúc vào thời gian cuối tháng 11 dƣơng lịch. Nguyên liệu do Thạc sỹ Nguyễn Quốc Bình- cán bộ viện bảo tàng thực vật Việt Nam thu mua, giám định và cung cấp.
Mẫu sau khi thu mua đƣợc rửa sạch đất cát, loại bỏ rễ con và phần hƣ hỏng, thái ngang củ dày 2cm, phơi sấy ở nhiệt độ 450C, nghiền thành bột có cỡ hạt 2mm và bảo quản nơi khô ráo. Theo cách này từ 7kg thân rễ gừng gió tƣơi thì thu đƣợc 1kg bột thân rễ gừng gió hiệu suất 14,28%.
2.3.1.2. Điều chế cặn chiết không phân cực
1kg bột thân rễ gừng gió khơ (chuẩn bị ở phần 2.3.1.1) đƣợc ngâm với EtOH 96% trong bình chiết ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày.
Rút dịch chiết ra và ngâm lại 2 lần nữa với EtOH 96%. Gộp dịch chiết và cất loại EtOH 96% đến khi cịn 1/5 thể tích bình cầu, cho thêm 4/5 thể tích nƣớc muối và chiết 3 lần bằng n-hexan. Gộp dịch chiết n-hexan làm khô bằng Na2SO4 khan, cất loại n-hexan thu cặn không phân cực 40g, hiệu suất 4,0% tính theo ngun liệu khơ.
2.3.1.3. Phân lập Zerumbone có chất lƣợng cao từ cặn chiết khơng phân cực bằng sắc ký cột bằng sắc ký cột
Cho một lƣợng n-hexan vào 20,5g cặn không phân cực đến lúc tan hết, cho thêm 20,5g Silicagel cỡ hạt 40-63m theo phƣơng pháp nhồi ƣớt với n-hexan.
Rửa cột bằng hệ dung môi n-hexan/EtOAc 9/1 với tốc độ rửa 5ml/ phút và thu thành các phân đoạn, mỗi phân đoạn 10ml.
Kiểm tra các phân đoạn thu đƣợc bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM) với hệ dung môi n-hexan/EtOAc 9/1 và gom các phân đoạn chỉ cho một vệt có Rf và sắc phổ trùng với Rf và sắc phổ của Zerumbone chuẩn, loại dung môi, thu tinh thể và kết tinh lại thu đƣợc Zerumbone tinh khiết 3,7g, hiệu suất 0,74% tính theo nguyên liệu khô, quy ra nguyên liệu tƣơi là 0,10%.
Zerumbone thu đƣợc là tinh thể hình kim màu trắng, nóng chảy 66-670C. Nhiệt độ nóng chảy này khơng thay đổi khi trộn kỹ nó với Zerumbone chuẩn để thử lại, có Rf = 0,72 (dung mơi n-hexan/EtOAc 8/2) và sắc phổ màu vàng chanh với Vanillin/H2SO4 đặc 0,2% trùng với Rf và sắc phổ của Zer chuẩn trong cùng điều kiện sắc ký.
2.3.1.4. Phân lập Zerumbone chất lƣợng cao từ cặn chiết không phân cực bằng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng điều chế (SKLMĐC) bằng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng điều chế (SKLMĐC)
a/ Khảo sát phần chiết không phân cực của thân rễ gừng gió bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM)
Khảo sát cặn chiết không phân cực bằng SKLM với nhiều loại dung môi khác nhau: n-hexan, EtOAc, xeton, EtOH… và các hỗn hợp của chúng với các tỉ lệ khác nhau. Cuối cùng chúng tôi chọn đƣợc hệ dung môi n-hexan/EtOAc 95/5 v/v là hệ tốt nhất cho SKLM điều chế cặn chiết khơng phân cực của thân rễ gừng gió. Với hệ dung môi này vệt chất của Zerumbone tách bạch khỏi các vệt chất khác một cách rõ rệt, nó có Rf = 0,65, Rf đối với vệt chất ở trên là 0,12 và đối với vệt chất ở dƣới là 0,15. Kết quả này đƣợc chỉ ra trên bảng 2.1.
Bảng 2.1: Rf và sắc phổ các thành phần trong cặn không phân cực
STT Rf Vanillin/H2SO4(nguội) Vanillin/H2SO4(nóng) FeCl3 1M
1 0,92 Hồng nhạt Nâu Không hiện
2 0,87 Hồng đậm Nt Nt
4 0,80 Đỏ Nt nt 5 0,77 Đỏ sẫm Nt nt 6 0,65 Vàng chanh Nâu nhạt nt 7 0,50 Tím Nâu đậm nt 8 0,47 Tím đậm Nt nt 9 0,39 Nâu Nt nt
Kết quả trên cho thấy thành phần có hàm lƣợng lớn trong cặn khơng phân cực của thân rễ gừng gió khá lớn (9 thành phần). Tất cả chúng đều không phải là phenolic hay flavanoit.
b/ SKLMĐC phân lập Zerumbone
Hịa tan 2g phần chiết khơng phân cực của thân rễ gừng gió vào 2ml n-hexan rồi dùng capila có đƣờng kính 1mm, mao dẫn dung dịch thu đƣợc rồi nhỏ lên bản thủy tinh chuyên dùng cho SKLMĐC của hãng Merk, ký hiệu là PLC 60F254 2mm, có kích thƣớc 2020 cm thành 1 vạch liên tục cách cạnh dƣới 1cm, cạnh bên 0,5cm.
Cho bản vừa chuẩn bị vào bình triển khai sắc ký đã có dung mơi n-hexan/EtOAc 95/5 v/v thích hợp và tiến hành sắc ký cho đến lúc tuyến dung môi cách mép trên 0,5cm thì lấy bản ra, làm khô và hiện sắc phổ bằng cách bịt kín mặt lớp mỏng bằng tấm bìa cách cạnh bên 1cm và có 2 rãnh hở, mỗi khe hở rộng 0,3cm, dầi bằng bản mỏng và chia bản mỏng thành 3 phần bằng nhau; phun vanillin 0,2% trong H2SO4 đặc, khoanh vùng gồm 4 vệt: 2 vệt vàng ở hai bên cạnh và 2 vệt vàng ở 2 rãnh bằng bút chì 2B, rồi cạo lấy lớp silicagel ở trong vòng đã đánh dấu.
Giải hấp Zerumbone trong bột Silicagel thu đƣợc bằng n-hexan ở 500C, lọc lấy dung dịch n-hexan rồi loại n-hexan, kết tinh lại sản phẩm, thu đƣợc 0,3g Zerumbone, hiệu suất 0,60% tính theo ngun liệu khơ và 0,08% tính theo ngun liệu tƣơi.
nhất với các hằng số vật lý của Zerumbone chuẩn khi tiến hành thử nghiệm so sánh. Do đó, nó là sản phẩm chính xác.
2.3.1.5. Điều chế zerumbone có chất lƣợng cao từ cặn chiết phần không phân cực bằng phƣơng pháp kết tinh phân đoạn cực bằng phƣơng pháp kết tinh phân đoạn
Kết tinh chậm 40g cặn không phân cực (điều chế ở 2.3.1.2) ở nhiệt độ thấp
và thời gian thích hợp, lọc lấy tinh thể Zerumbone thô rồi kết tinh phân đoạn Zerumbone ở nhiệt độ thấp và trong hệ dung mơi thích hợp thu đƣợc 24,5g Zerumbone tinh khiết hiệu suất 0,35% tính theo nguyên liệu tƣơi ban đầu.
Zerumbone thu đƣợc là tinh thể hình kim mầu trắng có các hằng số vật lý, Rf và sắc phổ trùng với các chỉ số này của Zerumbone chuẩn khi tiến hành thử nghiệm trong cùng điều kiện.
Zerumbone tinh khiết đã đƣợc xác định cấu trúc bằng những phƣơng pháp phổ khác nhau nhƣ phổ hồng ngoại (IR), khối phổ (MS), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1
H-NMR,13C-NMR. Kết quả của các phổ đƣợc hiển thị ở chƣơng 3.
2.3.1.6. Quy trình điều chế Zerumbone chất lƣợng cao
a. So sánh hiệu suất và chất lƣợng sản phẩm của 3 phƣơng pháp điều chế