2.4.1. Phương pháp phân tách các dịch chiết
Nguyên liệu thực vật được nghiền nhỏ, ngâm chiết 3 lần với MeOH ở nhiệt độ phòng. Dịch chiết MeOH được cất loại dung môi dưới áp suất giảm cho phần chiết MeOH tương ứng. Phần chiết này sau đó được chiết với các dung môi theo độ phân cực tăng dần: n-hexan, diclomethan, ethyl acetat cho các phần chiết tương ứng.
2.4.2. Các phương pháp phân tích, phân tách hỗn hợp và phân lập các hợp chất
a) Phương pháp chiết hai pha lỏng
Phương pháp dựa trên sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha lỏng khơng hịa trộn (một pha nước và một pha dung môi hữu cơ). Các hợp chất hữu cơ sẽ được chuyển từ một pha nước sang một pha hữu cơ còn các chất nền phân cực sẽ ở lại trong pha nước. Phần chiết MeOH đó được chiết với các dung mơi theo độ phân cực tăng dần: n-hexan, diclometan cho các phần chiết tương ứng
b) Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng là phương pháp phân tích để lựa chọn các hệ dung môi rửa giải cho sắc ký cột. Đồng thời, đánh giá định tính số lượng các hợp chất có trong hỗn hợp.
Phát hiện vệt chất trên bản mỏng
Bản mỏng được phun vanillin/H2SO4 đặc 1%, sau đó được hơ nóng ở 120C, đánh dấu vệt chất trên bản mỏng, tính giá trị Rf và ghi màu sắc của các vệt chất.
c) Sắc ký cột
Nhồi cột sắc ký: Phương pháp nhồi cột ướt
Một lượng silica gel ứng với cột sắc ký có đường kính và chiều cao cột thích hợp được khuấy đều thành bột nhão trong một lượng vừa đủ n-hexan khan. Bột nhão này được loại hết bọt khí và nhồi vào cột sắc ký. Có thể dùng bơm nén hoặc trọng lực dung môi n-hexan đi qua cột nhiều lần cho đến khi lớp silica gel hoàn toàn ổn định.
Đưa mẫu lên cột sắc ký: Phương pháp tẩm mẫu trên silica gel
Mẫu được hòa tan trong một lượng vừa đủ dung môi dễ bay hơi thích hợp. Trộn dung dịch thu được với silica gel với tỷ lệ là 1 g chất /1,2 g đến 1,5 g silica gel. Hỗn hợp này được làm bay hơi dung môi đến khi khô kiệt thu được bột mịn của mẫu chất hấp phụ trên silica gel. Bột này được đưa lên cột sắc ký phía trên lớp chất hấp phụ silica gel.
Triển khai sắc ký cột
Mở khóa dưới cột sắc ký để cho dung môi chảy ra khỏi cột sắc ký, cho đến khi bề mặt dung môi cách bề mặt silica gel khoảng 2 mm. Cho từ từ mẫu tẩm trên silica
gel lên cột. Khi đưa mẫu lên cột cần phải chú ý đảm bảo cho bề mặt của lớp chất phía trên cột sắc ký tạo thành mặt phẳng ngang. Tiến hành rửa giải bằng hệ dung môi được xác định nhờ vào các khảo sát TLC, tốc độ rửa giải 20 giọt/phút, thu các phân đoạn theo thể tích 150 ml, 50 ml và 20 ml (CC). Với cột sắc ký tinh chế (Mini-C) các phân đoạn được thu theo thể tích 3-5 ml.
Khảo sát sắc ký các phân đoạn
Tiến hành khảo sát các phân đoạn nhận được bằng TLC, gộp các phân đoạn cho sắc ký đồ TLC giống nhau lại, sau đó cất loại kiệt dung môi để thu được các nhóm phân đoạn. Sắc ký cột thường (CC) và sắc kí cột tinh chế (Mini-C) được thực hiện trên silica gel Merck (Merck, Darmstadt, CHLB Đức) với các cỡ hạt tương ứng là 63-200 m, 40-63 m và 15-40 m.
d) Phương pháp kết tinh lại
Phương pháp này chủ yếu được sử dụng để phân lập và tinh chế chất rắn. Việc làm sạch chất rắn bằng kết tinh là dựa trên sự khác nhau về độ tan của chất và tạp chất trong dung môi hoặc hệ dung môi đã chọn và độ tan của chất ở các nhiệt độ khác nhau.
2.4.3. Các phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ
Phổ khối lượng ion hóa phun bụi điện tử (ESI-MS)
Phổ khối lượng ion hóa phun bụi điện tử được ghi trên thiết bị Agilent Ion Trap.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ cộng từ hạt nhân proton (1H-NMR, 500 MHz) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 (13C-NMR, 125 MHz) được ghi trên thiết bị Bruker AV 500 spectrometer. Độ dịch chuyển hóa học (δ) được biểu thị theo ppm. Phổ 13C-NMR với chương trình DEPT cho biết thơng tin về các loại carbon (C, CH, CH2, CH3) trong phân tử.
Phổ hồng ngoại (IR)
Phổ IR cung cấp thông tin về các nhóm chức có mặt trong phân tử hợp chất hữu cơ. Phổ IR được đo trên thiết bị Shimadzu FT-IR Affinity-1S.
Chương 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU