Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.2.3. Định danh nấm bằng giải trình tự vùng ITS
Quá trình thu hệ sợi và tách chiết DNA tổng số từ hệ sợi nấm đƣợc tiến hành theo Nguyễn Thị Khuyến và cộng sự (2015) [3].
Nuôi cấy và thu hệ sợi nấm:
Chủng nấm sau khi xác định dựa vào hình thái bên ngồi đem tiến hành nuôi lắc trong môi trƣờng PDB (potato dextrose broth) ở nhiệt độ 25˚C, 200 vòng/phút. Sau 3 ngày dịch nuôi đƣợc lọc qua màng Miracloth (Calbiochem, Đức). Hệ sợi nấm trên màng đƣợc loại bỏ nƣớc bằng giấy thấm sạch. Sau đó sợi đƣợc chia ra ống eppendorf 2ml (khoảng 200mg/ống). Hệ sợi đƣợc sử dụng cho thí nghiệm tách chiết DNA tổng số.
Tách chiết DNA tổng số từ hệ sợi nấm:
Bƣớc 1: Mỗi ống chứa sợi đƣợc giã nhỏ bằng đũa thủy tinh trong 1 phút rồi bổ sung 600µl đệm tách (SDS 2,5%, 200mM Tris-HCl pH 8, NaCl 250mM, EDTA 25mM, β-mercaptoethanol 0,2%) + 2µlproteinase K, trộn và ủ ở 60oC, 15 phút.
Bƣớc 2: Bổ sung thêm 300µl natri acetat 3M (pH=5,2). Ly tâm lạnh ở 4oC, 13000 vòng/ phút trong 20 phút.
Bƣớc 3: Hút dịch nổi sang ống eppendorf mới bằng pipet và bổ sung một thể tích tƣơng ứng bằng isopropanol lạnh để kết tủa DNA. Ống đƣợc ly tâm lạnh với tốc độ 13000 vòng/phút trong 10 phút để thu tủa.
Bƣớc 4: Bổ sung từ 0,7-1ml ethanol 70% để rửa tủa. Ly tâm lạnh ở 13000 vòng/phút trong 5 phút để thu tủa.
Bƣớc 5: Bỏ dịch nổi. Sử dụng máy cơ quay chân khơng để làm khơ mẫu sau đó bổ sung 50µl đệm TE 1X (Tris-EDTA) và 2µl RNase ủ ở 60oC, 30 phút để loại bỏ ARN.
Phản ứng PCR khuếch đại vùng ITS của nấm với cặp mồi ITS1/ITS4:
Thành phần phản ứng PCR (tổng thể tích 25 µl/phản ứng): Buffer 10X for Phusion: 2,5µl
dNTP: 1µl Mồi ITS1: 1µl Mồi ITS4: 1µl Phusion polymerase: 1µl DNA khn: 1µl Nƣớc vơ trùng: 17,5µl Chu trình nhiệt: 94˚C 6 phút 94˚C 30 giây 58˚C 30 giây 72˚C 1 phút 72˚C 10 phút 4˚C ∞
Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel agarose 0,8%, 90V trong 30 phút. Tinh sạch sản phẩm PCR chuẩn bị cho giải trình tự
Sản phẩm PCR đƣợc phân tích trên gel agarose 0,8%. Băng DNA có kích thƣớc khoảng hơn 500 bp là sản phẩm tƣơng ứng với vùng ITS của rDNA ở nấm. Băng này đƣợc cắt khỏi bản gel agarose và đƣợc tinh sạch bằng kít tinh sạch của hãng Promega.
Giải trình tự sản phẩm PCR và phân tích dữ liệu
Mẫu DNA tinh sạch từ sản phẩm PCR đƣợc giải trình tự theo phƣơng pháp Sanger bởi công ty 1st Base, Singapore. Các trình tự DNA sau đó đƣợc phân tích bằng phần mềm BioEdit 7.2 và so sánh với dữ liệu có sẵn trong Ngân hàng gen của NCBI (GenBank) sử dụng chƣơng trình BLAST. Các dữ liệu liên quan đƣợc trích xuất ở định dạng FASTA để phục vụ cho phân tích phát sinh chủng loại.
Phân tích mối quan hệ lồi dựa trên trình tự ITS với phần mềm MEGA6. Các trình tự DNA của các chủng nấm nghiên cứu và các trình tự liên quan trích xuất từ GenBank đƣợc nạp vào MEGA6 và đƣợc so sánh với nhau sử dụng tính năng ClustalW tích hợp sẵn trong phần mềm. Cây phát sinh chủng loại đƣợc xây dựng dựa trên phƣơng pháp Neigbor-joining với độ tin cậy sử dụng mô hình sao chép mẫu (bootstrap) 1000 lần. Hình cây phân loại đƣợc hoàn thiện với phần mềm xử lý ảnh Adobe Illustrator CS6.
2.2.3. Xác định ảnh hƣởng của một số yếu tố trong q trình ni trồng quả thể nấm C.cicadae
2.2.3.1. Ảnh hƣởng của một số yếu tố trong giai đoạn nhân giống - Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên sự sinh trƣởng của hệ sợi nấm C.cicadae - Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên sự sinh trƣởng của hệ sợi nấm C.cicadae
Thí nghiệm ni cấy nấm trong các thang nhiệt độ: 15, 20, 25 và 30˚C trên môi trƣờng PDA. Tiến hành cấy 10 μl dịch bào tử nấm C. cicadae ở nồng độ 106
bào tử/ml, đem nuôi ở các thang nhiệt độ khác nhau, cùng điều kiện ánh sáng. Xác định sự sinh trƣởng của hệ sợi thơng qua việc đo đƣờng kính sinh trƣởng của khuẩn lạc sau 4, 6, 8, 10 ngày.
- Ảnh hƣởng của chế độ lắc lên sự sinh trƣởng của nấm C.cicadaetrong tạo
giống dịch thể
Môi trƣờng giống dịch thể đƣợc lựa chọn là môi trƣởng PDB (potato dextrose broth), 100ml môi trƣờng cấy 1 cm2 khuẩn lạc, đem nuôi trên máy lắc ở các chế độ lắc 100, 150, 200 vòng/phút ở cùng điều kiện nhiệt độ, khơng có ánh sáng, trong
thời gian 7 ngày. Tiến hành lọc qua gạc hoặc vỉ lọc vô trùng rồi tiến hành xác định nồng độ bào tử nấm bằng buồng đếm hồng cầu.
2.2.3.2. Ảnh hƣởng của một số yếu tố trong giai đoạn ƣơm sợi - Ảnh hƣởng của thành phần dinh dƣỡng môi trƣờng - Ảnh hƣởng của thành phần dinh dƣỡng mơi trƣờng
Thí nghiệm thực hiện với 4 loại mơi trƣờng dinh dƣỡng khác nhau. MT1: 20g gạo trắng, 5g bột nhộng tằm tƣơi
MT2: 20g gạo lứt, 5g bột nhộng tằm tƣơi MT3: 20g gạo trắng, 5g bột sâu chít tƣơi MT4: 20g gạo lứt, 5g bột sâu chít tƣơi
Mỗi lọ mơi trƣờng ni nấm đƣợc bổ sung 50 ml dịch dinh dƣỡng. Thành phần 1lít dịch dinh dƣỡng gồm dịch chiết từ 200g khoai tây, 20g glucose, 1g pepton.
Các thành phần trên đƣợc phối trộn đều và tiến hành chia đều ra các lọ thủy tinh trong hình trụ, đƣờng kính 8,5 cm, thể tích 500 ml, rồi đƣa vào hấp khử trùng ở 121˚C trong 30 phút. Môi trƣờng sau khi hấp sẽ đƣợc làm nguội tự nhiên trƣớc khi đem cấy giống.
Tiến hành cấy 1ml giống cho mỗi lọ. Dịch giống có nồng độ bào tử là 106 bào tử/ml. Ni ở nhiệt độ 20˚C, độ ẩm 80% và không chiếu sáng. Xác định thời gian hệ sợi phát triển kín cơ chất.
- Ảnh hƣởng của lƣợng giống cấy
Thí nghiệm đƣợc tiến hành với 3 liều lƣợng giống cấy khác nhau: 0,5, 1 và 1,5 ml. Tiến hành cấy nấm đều trên bề mặt môi trƣờng với các lƣợng giống cấy nêu trên, cùng điều kiện nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng. Xác định sự ảnh hƣởng của lƣợng dịch giống tới sự phát triển của hệ sợi thông qua việc xác định thời gian hệ sợi nấm lan kín cơ chất. Đồng thời xác định tỉ lệ lọ cấy giống bị nhiễm.
Thí nghiệm đƣợc tiến hành với 3 nồng độ bào tử của dịch giống cấy: 104, 105 và 106bào tử/ml. Tiến hành cấy nấm đều trên bề mặt môi trƣờng ở các nồng độ bào tử khác nhau, cùng điều kiện nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng. Xác định sự ảnh hƣởng của nồng độ bào tử giống tới sự phát triển của hệ sợi thông qua việc xác định thời gian hệ sợi nấm lan kín cơ chất và tỉ lệ lọ cấy giống bị nhiễm.
2.2.3.3. Ảnh hƣởng của một số yếu tố tới sự hình thành và sinh trƣởng của quả thể nấm C.cicadae thể nấm C.cicadae
Đánh giá sự ảnh hƣởng của các yếu tố thơng qua thời gian hình thành quả thể, chiều dài quả thể và năng suất sinh học. Năng suất sinh học (Biological efficiency - BE) đƣợc tính theo phƣơng pháp của Shrestha (2012): Năng suất sinh học BE (%) = (khối lƣợng quả thể khô/ khối lƣợng cơ chất) x 100 [63].
- Ảnh hƣởng của thành phần dinh dƣỡng môi trƣờng
Nấm cấy trên 4 môi trƣờng ở trên trải qua giai đoạn ƣơm sợi sẽ đƣợc đƣa vào nuôi ở điều kiện nhiệt độ 20˚C, độ ẩm 80%, cƣờng độ chiếu sáng 500lux, chiếu sáng 12 giờ/ngày.
- Ảnh hƣởng của nhiệt độ
Xác định yếu tố nhiệt độ là yếu tố quan trong ảnh hƣởng tới việc hình thành và phát triển quả thể. Thí nghiệm đƣợc tiến hành ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau: 20, 25 và 30˚C. Nấm cấy trên môi trƣờng hỗn hợp trải qua giai đoạn ƣơm sợi (sợi nấm lan kín cơ chất) sẽ đƣợc đƣa vào các điều kiện nhiệt độ nuôi khác nhau, độ ẩm 80%, cƣờng độ chiếu sáng 500lux, chiếu sáng 12 giờ/ngày.
- Ảnh hƣởng của độ ẩm
Thí nghiệm đƣợc tiến hành ở các điều kiện độ ẩm khác nhau: 70, 80 và 90%. Nấm cấy trên môi trƣờng hỗn hợp trải qua giai đoạn ƣơm sợi (sợi nấm lan kín cơ chất) sẽ đƣợc đƣa vào các điều kiện độ ẩm nuôi khác nhau, cùng nhiệt độ, cƣờng độ chiếu sáng 500lux, chiếu sáng 12 giờ/ngày.
Thí nghiệm đƣợc tiến hành ở các điều kiện chiếu sáng khác nhau: 200lux, 500lux, 1000lux (12h chiếu sáng/ngày). Nấm cấy trên môi trƣờng hỗn hợp trải qua giai đoạn ƣơm sợi (Sợi nấm lan kín cơ chất sau 15 ngày) sẽ đƣợc đƣa vào các điều kiện chiếu sáng khác nhau, cùng điều kiện nhiệt độ và độ ẩm.
2.2.4. Xác định một số hoạt chất quan trọng trong quả thể nấm C.cicadae
Tiến hànhxác định hàm lƣợng adenosine và cordycepin trong quả thể nấm
C.cicadae và cơ chất nuôi nấm trên hệ thống HPLC, thí nghiệm đƣợc tiến hành
tạiViện Thực phẩm Chức năng và Viện Khoa học Sự sống, Đại học Thái Nguyên.
2.2.5. Nghiên cứu tác động của dịch chiết quả thể nấm lên chuột thí nghiệm
Chiết dung dịch nấm: Theo phƣơng pháp của Jung và cộng sự (2004) [40]: 6g quả thể nấm C.cicadae đã đƣợc sấy khô, nghiền nhỏ đem đun cách thủy trong
nƣớc (chiết bằng nƣớc) hoặc đun cách thủy trong cồn 30% (chiết bằng cồn) ở nhiệt độ 70˚C trong 20 giờ. Điều chỉnh dung dịch nấm cịn 100ml/mẫu.
Bố trí thí nghiệm:
Chuột nhắt trắng chủng Swiss, giống đực, 4 tuần tuổi do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ƣơng cung cấp. Sau một tuần để chuột phục hồi và thích nghi với mơi trƣờng mới, chuột đƣợc chia làm 3 nhóm, mỗi nhóm 5 con, chuột thí nghiệm có trọng lƣợng ban đầu trung bình 19 g/con.
Nhóm 1: Cho chuột uống dịch chiết bằng nƣớc. Nhóm 2: Cho chuột uống dịch chiết bằng cồn Nhóm 3: Đối chứng (cho uống nƣớc tiệt trùng)
Chuột đƣợc nuôi theo cùng một chế độ dinh dƣỡng và theo dõi hàng ngày. Thí nghiệm đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp của Jung và cộng sự (2004) [40], liều uống dịch chiết quả thể nấm là 250 µl/chuột/ngày đối với chuột ở nhóm 1 và nhóm 2; nhóm 3 đối chứng đƣợc uống nƣớc tiệt trùng liên tiếp trong 4 tuần. Chuột ở các công thức đƣợc theo dõi các biểu hiện hình thái, sức sống, sự tăng trọng trong suốt q trình thí nghiệm.
Để đánh giá khả năng bơi, các nhóm chuột đƣợc tập bơi 3 lần/tuần, mỗi lần 15 phút, nhiệt độ của nƣớc ln duy trì ở khoảng 34±1˚C. Sau 4 tuần, chuột đƣợc cho bơi để tính thời gian từ lúc bắt đầu cho đến khi đuối sức.
Sau 4 tuần chuột ở các nhóm thí nghiệm đƣợc tiến hành lấy máu dùng cho phân tích các chỉ số sinh hóa máu: hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, hemoglobin, hematocrit, creatinin, GOT, GPT. Chuột sau khi lấy máu sẽ đƣợc tiến hành giải phẫu quan sát và so sánh giữa các nhóm đƣợc uống dịch chiết với nhóm đối chứng.
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập và định danh nấm C.cicadae 3.1. Phân lập và định danh nấm C.cicadae
3.1.1. Phân lập chủng nấm C.cicadae
Trong quá trình đi thực địa tại vùng rừng núi huyện Lục Ngạn, tỉnh Bắc Giang, chúng tôi đã thu thập đƣợc một mẫu nấm ký sinh trên ấu trùng ve sầu. Mẫu nấm đƣợc phát hiện ngồi tự nhiên khi cịn tƣơi, quả thể có màu trắng kem dạng giống hình chùm hoa, dài từ 2 - 4 cm, trên đầu quả thể có phủ một lớp bào tử dày màu trắng (hình 3.1 A).
Hình 3.1. Hình thái của chủng nấm nghiên cứu
(A)Mẫu nấm thu thập ngồi tự nhiên; (B)Hình thái hệ sợi và bảo tử nấm Từ phần đầu quả thể, tiến hành cấy gạt một lƣợng nhỏ bào tử sang đĩa môi trƣờng PDA. Chủng nấm sau đó đƣợc thuần khiết thơng qua phƣơng pháp nuôi cấy bào tử đơn. Sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trƣờng PDA, chủng nấm đã phân lập đƣợc
sinh trƣởng tạo hệ sợi màu trắng. Khi quan sát dƣới kính hiển vi có độ phóng đại 40 lần, hệ sợi quan sát đƣợc bao gồm cấu trúc phân đốt bởi các vách ngăn. Tiếp tục quan sát dƣới kính hiển vi sau 5 ngày nuôi cấy, chủng nấm nghiên cứu đã hình thành bào tử hình trứng (hình 3.1 B). Dựa trên khóa phân loại nấm của Barnett và Hunter (1972) và Luangsa-ard (2007)[15, 55], chúng tôi bƣớc đầu kết luận đây là loài thuộc chi Cordyceps và đặt tên là Cordyceps BG01.
3.1.2. Định danh chủng Cordycepssp.bằng giải trình tự vùng ITS
Do trình tự DNA của vùng sao chép nội bộ ITS của rDNA ở các lồi nấm vừa có trình tự bảo thủ vừa có các trình tự thay đổi nên các vùng ITS này đƣợc nghiên cứu cho mục đích phân loại nhiều lồi nấm. Ngoài ra, so với các gen 18S rRNA và 28S rRNA của rDNA,vùng ITS (gồm ITS1; 5,8S rRNA; ITS2)ở nấm có mức độ biến đổi cao hơn giữa các lồi gần gũi[24].Trong nghiên cứu này, chúng tơi sử dụng cặp mồi đa năng ITS1/ITS4 để khuếch đại vùng ITS của chủng nấm
CordycepsBG01 (hình 3.2 A).
Chủng CordycepsBG01 đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng PDB trong thời gian 3 ngày ở điều kiện 25oC, tốc độ lắc 200vòng/phút để thu hệ sợi phục vụ tách chiết DNA. Điện di kiểm tra sản phẩm DNA tổng số trên gel agarose 0,8% cho thấy chất lƣợng DNA thu đƣợc đủ tốt để dùng cho phản ứng PCR (hình 3.2 B). Kết quả khuếch đại vùng ITS với cặp mồi đa năng cho nấm là ITS1/ITS4 trên gel agarose chỉ ra 1 băngDNAduy nhất, có kíchthƣớc khoảng 544 bp(hình 3.2 C).
Sản phẩm PCR vùng ITS đƣợc tinh sạch bằng kit tinh sạch của hãng Promegavà đƣợc giải trình tự theo phƣơng pháp Sanger. Kết quả phân tích trình tự, so sánh với dữ liệu trong ngân hàng gen GenBankvà xây dựng cây phát sinh chủng loại chỉ ra rằng chủng CordycepsBG01 phân lập đƣợc chính là Cordycepscicadae
với độ tƣơng đồng về trình tự ITS của rDNA là 100%(hình 3.2 D). Chủng nấm sau khi phân loại đƣợc kí hiệu là Cordycepscicadae BG01.
Hình 3.2. Phân loại chủng nấm C.cicadae BG01
(A) Sơ đồ khuếch đại vùng ITS bởi cặp mồi ITS1/ITS4; (B) DNA tổng số; (C): Sản phẩm khuếch đại vùng ITS; (D): Cây phân loại dựa trên trình tự vùng ITS
3.2. Ảnh hƣởng của một số yếu tố trong nuôi trồng quả thể nấm C.cicadae
BG01
3.2.1. Ảnh hƣởng của một số yếu tố trong giai đoạn nhân giống 3.2.1.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên sự sinh trƣởng của hệ sợi nấm
Để đánh giá sự sinh trƣởng của hệ sợi nấm C.cicadaeBG01 ở các điều kiện
nhiệt độ, chúng tôi tiến hành cấy 10 μl dịch bào tử nấm ở nồng độ 106 bào tử/ml trên môi trƣờng PDA, không chiếu sáng.Kết quả nghiên cứu cho thấy, hệ sợi nấm
C.cicadaeBG01sinh trƣởng đƣợc trong khoảng nhiệt độ 15˚C - 30˚C,tuy nhiên sự
sinh trƣởng có sự khác nhau rất rõ rệt (hình 3.3). Ở nhiệt độ 30˚Chệ sợi nấm sinh trƣởng rất yếu. Hệ sợi nấm C.cicadaeBG01 sinh trƣởng mạnh trong khoảng nhiệt
độ 15˚C - 25˚C. Đây cũng là khoảng nhiệt độ bắt gặp loài nấm này trong tự nhiên [20, 87]. Khi so sánh với loài nấm cùng chi đang đƣợc nghiên cứu nhiều là C. militaris nhận thấy hai loài nấm này sinh trƣởng trong khoảng nhiệt độ tƣơng đƣơng
nhau. Theo Hung và cộng sự (2009), 15 chủng C. militaris nghiên cứu đều sinh
trƣởng thích hợp trong khoảng 15˚C - 20˚C[35]. Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu trên loài C.cicadae đều chƣa đƣa ra nhiệt độ tối ƣu cho sự sinh trƣởng của hệ sợi
nấm. Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy 20˚C là nhiệt độ tối ƣu cho sự sinh trƣởng của hệ sợi nấmC.cicadaeBG01. Từ kết quả này, chúng tôi tiến hành các nghiên cứu xác định sự ảnh hƣởng của các yếu tố khác đến sự sinh trƣởng của sợi nấm ở điều kiện nhiệt độ 20˚C.
Hình 3.3. Sinh trƣởng của hệ sợi nấmC. cicadae BG01 ở các điều kiện nhiệt độ
3.2.1.2. Ảnh hƣởng của chế độ lắc trong tạo giống dịch thể
Hiện nay việc sử dụng giống nấm dạng dịch thể trong nuôi trồng nấm mang lại hiệu quả rõ rệt nhƣ rút ngắn thời gian ƣơm sợi, giống khỏe, tỉ lệ nhiễm giảm, tiết kiệm chi phí và thích hợp cho ni trồng quy mơ cơng nghiệp, nên việc tạo giống dịch thể đƣợc áp dụng cho nhiều lồi nấm trong đó có nấm thuộc chi Cordyceps[6,
81]. Môi trƣờng giống dịch thể đƣợc lựa chọn trong nghiên cứu này là môi trƣởng PDB(potato dextrose broth), 100ml môi trƣờng cấy 1 cm2 khuẩn lạc, đem nuôi trên máy lắc ở các chế độ lắc 100, 150, 200 vịng/phút ở điều kiện nhiệt độ 20˚C, khơng có ánh sáng, trong thời gian 7 ngày. Tiến hành lọc qua gạc hoặc vỉ lọc vô trùng rồi tiến hành xác định nồng độ bào tử nấm bằng buồng đếm hồng cầu. Kết quả thu đƣợc cho thấy trên môi trƣờng PDB sau 7 ngày nuôi lắc, hệ sợi nấm đã phát triển