Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2. Ảnh hƣởng của một số yếu tố trong nuôi trồng quả thể nấmC.cicadaeBG01
3.2.2.2. Ảnh hƣởng của nồng độ bào tử dịch giống lên sự sinh trƣởng hệ sợ
kín cơ chất, nhanh hơn so với trên 3 mơi trƣờng cịn lại (MT1, MT3 và MT4) (hình 3.5).
Hình 3.5. Thời gian hệ sợi nấm C. cicadae BG01 lan kín trên các mơi trƣờng
3.2.2.2. Ảnh hƣởng của nồng độ bào tử dịch giống lên sự sinh trƣởng hệ sợi nấm nấm
Để xác định nồng độ bào tử của dịch giống thích hợp, chúng tơi tiến hành cấy 1 ml giống nấm C. cicadaeđều trên bề mặt môi trƣờng ở 3 nồng độ bào tử nấm khác nhau: 104, 105 và 106bào tử/ml. Nấm đƣợc nuôi trên môi trƣờng MT2, trong điều kiện nhiệt độ 20˚C, độ ẩm 80%, không chiếu sáng. Kết quả cho thấy, ở công thức cấy với nồng độ bào tử là 104 và 105bào tử/ml sau 10 - 12 ngày, hệ sợi nấm lan kín cơ chất, tuy nhiên hệ sợi phát triển khá mỏng. Với nồng độ bào tử giống cấy là 106bào tử/ml, trung bình sau 7,53 0,64 ngày hệ sợi lan kín mơi trƣờng một lớp dày (hình 3.6).
Hình 3.6. Thời gian hệ sợi nấm C. cicadae BG01 lan kín mơi trƣờng với các nồng độ bào tử dịch giống cấy khác nhau
Ở cả 3 công thức nồng độ bào tử, chúng tôi nhận thấy giống cấy đều phát triển với tỉ lệ giống chết là 0%. Khơng nhiễm nấm mốc ở điều kiện giống có nồng độ bào tử 105và 106bào tử/ml. Ở nồng độ dịch giống 104 bào tử/ml, tỉ lệ nhiễm mốc trung bình là 2%. Điều này càng khẳng định tốc độ lan kín cơ cơ chất của hệ sợi nấm càng nhanh sẽ giảm sự nhiễm tạp từ môi trƣờng. Nhƣ vậy nồng độ bào tử của dịch giống cấy là 106bào tử/ml đáp ứng đƣợc yêu cầu trong q trình ni cấy.
3.2.2.3. Ảnh hƣởng của lƣợng giống cấy lên sự sinh trƣởng hệ sợi nấm
Lƣợng giống cấy là một thơng số quan trọng trong quy trình ni trồng nấm. Nếu lƣợng giống q ít thì thời gian hệ sợi lan kín mơi trƣờng lâu, nhƣng nếu cấy quá nhiều sẽ gây lãng phí giống. Nhƣ vậy thí nghiệm này đƣợc tiến hành nhằm xác định lƣợng giống cấy thích hợp. Để xác định lƣợng giống cấy thích hợp, chúng tơi tiến hành cấy giống nấm C. cicadae BG01 với 3 liều lƣợng giống cấy khác nhau:
0,5, 1 và 1,5 ml (106 bào tử/ml). Tiến hành cấy giống nấm đều trên bề mặt môi trƣờng MT2. Nấm đƣợc nuôi trong điều kiện nhiệt độ 20˚C, độ ẩm 80%, khơng
chiếu sáng. Để tìm ra lƣợng giống cấy phù hợp, chúng tôi tiến hành xác định thời gian hệ sợi nấm lan kín cơ chất trong lọ. Kết quả thể hiện trong hình 3.7.
Hình 3.7. Thời gian hệ sợi nấm C. cicadae BG01 lan kín mơi trƣờng với các lƣợng giống cấy khác nhau
Với lƣợng giống cấy 1 ml và 1,5 ml chỉ sau khoảng 7,47 - 7,53 ngày nuôi cấy, hệ sợi nấm C. cicadae BG01 lan kín cơ chất. Ở phƣơng thức cấy 0,5 ml, thời gian hệ sợi nấm lan kín cơ chất khá lâu, trung bình sau 11,670,72 ngày ni cấy.Đặc biệt, trong thí nghiệm này chúng tơi đã tiến hành thống kê lại tỉ lệ lọ hỏng do giống chết hoặc nhiễm nấm mốc. Kết quả cho thấy cả 3 phƣơng thức cấy, giống cấy đều phát triển với tỉ lệ giống chết là 0%. Tỉ lệ nhiễm nấm mốc ở phƣơng thức cấy 0,5 ml là 5%, trong khi ở cả 2 phƣơng thức cấy còn lại tỉ lệ nhiễm nấm mốc là 0%. Điều này chứng tỏ tốc độ lan kín cơ chất của hệ sợi nấm càng nhanh sẽ ức chế sự phát triển của nấm mốc. Nhƣ vậy lƣợng giống cấy 1 ml và 1,5 ml đều đáp ứng đƣợc yêu cầu trong q trình ni cấy. Nhƣng theo tính tốn về hiệu quả kinh tế, lƣợng giống cấy là 1 ml phù hợp hơn. Vì vậy, chúng tơi lựa chọn lƣợng giống cấy 1 ml là lƣợng giống cấy tối ƣu.
3.2.3. Ảnh hƣởng của một số yếu tố tới sự hình thành và sinh trƣởng của quả thể nấm
Giai đoạn tạo quả thể là giai đoạn hết sức quan trọng bởi chính các điều kiện trong giai đoạn này sẽ quyết định sựhình thành phát triển quả thẻ từ hệ sợi. Nếu thiếu các điều kiện này nấm chỉ phát triển và tồn tại ở dạng hệ sợi.Trong nghiên cứu này, chúng tôi xác định sự ảnh hƣởng của thành phần dinh dƣỡng môi trƣờng, nhiệt độ, độ ẩm và cƣờng độ ánh sáng ảnh hƣởng tới sự hình thành và phát triển quả thể nấm C. cicadae BG01 thông qua các chỉ tiêu thời gian hình thành quả thể, kích
thƣớc quả thể, năng suất sinh học và đặc điểm hình thái quả thể.
3.2.3.1. Ảnh hƣởng của thành phần dinh dƣỡng mơi trƣờng tới sự hình thành và sinh trƣởng của quả thể nấm
Sau khi cấy giống, nấm sẽ đƣợc nuôi ở nhiệt độ 20˚C, độ ẩm 80%, không chiếu sáng. Sau khoảng 8 - 9 ngày, hệ sợi nấm lan kín cơ chất. Các bình ni đƣợc chuyển qua chiếu sáng 12 giờ/ngày với cƣờng độ chiếu sáng 500 lux. Nhận thấy trên cả 4 môi trƣờng nghiên cứu, nấm C. cicadae BG01 đều hình thành quả thể. Quả thể nấmphân nhánh mạnh, màu trắng kem, đầu quả thể nhiều bào tử.Trên môi trƣờng MT2 quả thể nấm hình thành sớm nhất trung bình sau 16,8 0,94 ngày (tính từ ngày cấy giống). Đồng thời sau 50 ngày nuôi cấy, trên môi trƣờng MT2 quả thể nấm cho kích thƣớc và năng suất sinh học cao nhất tƣơng ứng là 5,51cm và 9,85% (hình 3.8). Kết quả cho thấy thành phần gạo lứt và nhộng tằm thích hợp cho sự hình thành và sinh trƣởng của quả thể nấm C. cicadae BG01. Đây cũng là mơi trƣờng
Hình 3.8. Sự ảnh hƣởng của thành phần dinh dƣỡng mơi trƣờng lên sự hình thành và phát triển quả thể nấm C. cicadae BG01
A: Thời gian hình thành quả thể; B: Kích thƣớc quả thể sau 50 ngày nuôi; C: Năng suất sinh học; D: Quả thể nấm ở các môi trƣờng nuôi khác nhau
3.2.3.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới sự hình thành và sinh trƣởng của quả thể nấm
Trong nghiên cứu này, nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trọng trong việc kích thích hình thành quả thể. Nấm cấy trên môi trƣờng MT2 trải qua giai đoạn ƣơm sợi đƣợc nuôi trong điều kiện độ ẩm 80%, cƣờng độ chiếu sáng 500 lux, chiếu sáng 12 giờ/ngày ở các nhiệt độ 20, 25 và 30˚C.Nhận thấy quả thể nấm chỉ hình thành ở 2 điều kiện nhiệt độ là 20˚C và 25˚C. Ở nhiệt độ 30oC quả thể nấm khơng hình thành. Tuy nhiên, ở điều kiện nhiệt độ 20oC quả thể nấm đƣợc hình thành sớm, kích thƣớc quả thể và năng suất sinh học cao hơn so với ở điều kiện 25˚C (hình
3.9). Quan sát hình dạng quả thể nấm C. cicadaeBG01 sau 50 ngày nuôi cấy ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau, chúng tôi nhận thấy ở công thức nhiệt độ 20oC quả thể nấm to đều và phân nhánh mạnh, màu trắng kem, đầu quả thể nhiều bào tử hơn ở quả thể nấm nuôi cấy ở công thức nhiệt độ 25˚C. Wang và cs (2012) đã chỉ ra chủng nấm C.cicadae phân lập tại Trung Quốc hình thành quả thể ở 25˚C, tuy nhiên các tác giả chƣa đƣa ra nhiệt độ tối ƣu cho sự hình thành và sinh trƣởng của quả thể nấmC.cicadae[70]. Nhƣ vậy, điều kiện nhiệt độ thích hợp cho sự hình thành và phát triển quả thể lànhiệt độ 20˚C. Điều kiện nhiệt độ này sẽ đƣợc chúng tôi lựa chọn cho nghiên cứu sự ảnh hƣởng của độ ẩm đến việc hình thành phát triển quả thể nấm
C.cicadae BG01.
Hình 3.9. Sự ảnh hƣởng nhiệt độ lên sự hình thành và phát triển quả thể nấm C.
cicadae BG01
A: Thời gian hình thành quả thể; B: Kích thƣớc quả thể sau 50 ngày nuôi; C: Năng suất sinh học; D: Quả thể nấm ở các nhiệt độ nuôi khác nhau
3.2.3.3. Ảnh hƣởng của độ ẩm tới sự hình thành và sinh trƣởng của quả thể nấm
Chúng tơi bố trí thí nghiệm ni nấm giai đoạn tạo quả thể ở các điều kiện độ ẩm khác nhau là 70, 80 và 90%.Nấm cấy trên môi trƣờng MT2 trải qua giai đoạn ƣơm sẽ đƣợc đƣa vào các điều kiện độ ẩm nuôi khác nhau, nhiệt độ 20oC, cƣờng độ chiếu sáng 500lux, chu kỳ chiếu sáng 12 giờ/ngày.Ở tất cả các điều kiện độ ẩm, nấm C. cicadaeBG01 đều hình thành quả thể. Ở điều kiện độ ẩm 90% quả thể nấm đƣợc hình thành sớm nhất, trung bình là 16,070,7ngày kể từ ngày cấy giống. Độ ẩm 70% quả thể nấm hình thành muộn nhất. Thời gian hình thành quả thể ngắn dần khi độ ẩm tăng dần từ 70% lên 90%. Nhƣ vậy, giai đoạn hình thành quả thể yêu cầu độ ẩm cao. Độ ẩm tăng vào giai đoạn này là một yếu tố kích thích sự hình thành quả thể.Đồng thời ở điều kiện này, kích thƣớc chiều dài quả thể lớn nhất và năng suất sinh học cao nhất (hình 3.10). Nhƣ vậy, độ ẩm tối ƣu cho sự hình thành và sinh trƣởng của quả thể là 90%.
Hình 3.10. Sự ảnh hƣởng độ ẩm lên sự hình thành và phát triển quả thể nấm C.
cicadae BG01
A: Thời gian hình thành quả thể; B: Kích thƣớc quả thể sau 50 ngày ni; C: Năng suất sinh học; D: Quả thể nấm ở các độ ẩm khác nhau
3.2.3.4. Ảnh hƣởng của cƣờng độ chiếu sáng tới sự hình thành và sinh trƣởng của quả thể nấm
Cƣờng độ ánh sáng ảnh hƣởng lớn tới q trình ni cấy tạo quả thể ở nấmCordyceps[60]. Tuy nhiên, chƣa ghi nhận công bố nào về ảnh hƣởng của cƣờng độ ánh sáng tới sự hình thành và sinh trƣởng của quả thể nấm C. cicadae.Nấm cấy trên môi trƣờng MT2 trải qua giai đoạn ƣơm sợi đƣợc đƣa vào các điều kiện chiếu sáng khác nhau, nhiệt độ 20˚C và độ ẩm 90%.Ở điều kiện chiếu sáng 500 lux quả thể nấm đƣợc hình thành sớm nhất. Ở các cơng thức chiếu sáng quả thể đều hình
thành, nhƣng kích thƣớc và năng suất sinh học thu đƣợc có sự khác nhau (hình 3.11).
Hình 3.11. Sự ảnh hƣởng cƣờng độ chiếu sáng lên sự hình thành và phát triển quả thể nấm C. cicadae BG01
A: Thời gian hình thành quả thể; B: Kích thƣớc quả thể sau 50 ngày nuôi; C: Năng suất sinh học; D: Quả thể nấm ở các cƣờng độ chiếu sáng khác nhau
Ở điều kiện chiếu sáng với cƣờng độ 500 lux quả thể phát triển cho kích thƣớc lớn nhất và đạt năng suất sinh học cao nhất tƣơng ứng là 6,02cm và 11,49%. Nhƣ vậy, điều kiện chiếu sáng thích hợp cho sự hình thành và sinh trƣởng của quả thể là cƣờng độ 500 lux. Với các điều kiện thích hợp đã đƣợc xác định, quả thể nấm phát triển mạnh, hình thức quả thể đẹp (hình 3.12).
Hình 3.12. Quả thể nấm C. cicadaeBG01 hình thành và phát triển ở điều kiện thích hợp
(mơi trƣờng MT2, nhiệt độ 20˚C, độ ẩm 90% với cƣờng độ chiếu sáng 500 lux).
3.3. Hàm lƣợng một số hoạt chất quan trọng trong quả thể nấm
Hàm lƣợng adenosine và cordycepin là hai chỉ tiêu quan trọng cho đánh giá chất lƣợng quả thể các loài nấm thuộc chi Cordyceps[53, 73]. Trong nghiên cứu
này, bƣớc đầu chúng tôi tiến hành đánh giá chất lƣợng quả thể nấm thơng qua việc phân tích hàm lƣợng adenosine và cordycepin trên hệ thống HPLC. Sau 50 ngày ni ở điều kiện thích hợp, chúng tơi tiến hành thu quả thể nấm và cơ chất. Quả thể nấm và cơ chất đƣợc tiến hành sấy trên hệ thống máy sấy đông khô tới khi độ ẩm đạt 10%. Kết quả phân tích hàm lƣợng adenosine và cordycepin đƣợc thể hiện trên hình 3.13. Đồng thời, thời gian thu hoạch sẽ ảnh hƣởng đến chất lƣợng quả thể. Quả thể thu hoạch đúng thời gian sẽcho chất lƣợng tốt, hàm lƣợng hoạt chất cao. Nếu thu hoạch non, quả thể chƣa phát triển hết, hàm lƣợng hoạt chất trong quả thể chƣa tích lũy đƣợc nhiều, dẫn chất lƣợng khơng cao. Nếu thu hoạch quágià, quả thể nấm
sẽ mất nƣớc, trở nên xù xì, sợi nấm thu đƣợc không đẹp, chất lƣợng cũng giảm đi. Do vậy, chúng tôi tiến hành xác định sự ảnh hƣởng của thời gian thu hoạch tới hàm lƣợng adenosine và cordycepin trong quả thể nấm, nhằm xác định thời gian thu hoạch quả thể nấm C. cicadae BG01 đạt chất lƣợng cao nhất (hình 3.14).
Hình 3.13. Hàm lƣợng adenosine và cordycepin trong quả thể nấm C. cicadaeBG01 và cơ chất sau 50 ngày ni trồng
Hình 3.14. Ảnh hƣởng của thời gian thu hoạch tới hàm lƣợng adenosine và cordycepin trong quả thể nấm C. cicadae
Từ kết quả thu đƣợc cho thấy hàm lƣợng adenosine và cordycepin trong quả thể nấm cao hơn rất nhiều so với trong cơ chất ni trồng có chứa hệ sợi nấm. Thời gian thu hoạch ảnh hƣởng rất nhiều tới hàm lƣợng adenosine và cordycepin trong quả thể nấm. Thời gian thu hoạch sau 50 ngày nuôi cấy là thời gian mà hàm lƣợng adenosine và cordycepin trong quả thể nấm đạt cao nhất, trung bình tƣơng ứng là 3,23 mg/g và 2,72 mg/g. Hàm lƣợng adenosine và cordycepin trong quả thể nấm ở nghiên cứu này tƣơng đƣơng với kết quả đã công bố của Li và cộng sự (2007) [48] và Lu và cộng sự (2015) [53]. Tuy nhiên khi so sánh với hàm lƣợng adenosine và cordycepin trong mẫu quả thể của chủng C. cicadaeMP12 nuôi trồng tại Trung
Quốc theo công bố của Wang và cộng sự (2012)[70], thì kết quả của chúng tơi đạt đƣợc cao hơn tƣơng ứng là 2,27 lần và 1,95 lần. Khi so sánh với các loài nấm khác cùng chi Cordyceps, hàm lƣợng cordycepin trong quả thể Cordyceps cicadae của
nghiên cứu này cao hơn trong quả thể nấm C. militaris (2,654 mg/g) và đặc biệt cao hơn trong quả thể nấm C. sinensis tự nhiên (0,9801 mg/g) thu thập tại Trung Quốc 2,77 lần[34]. Nhƣ vậy bƣớc đầu chúng tơi nhận định, với các điều kiện thích hợp đã xác định đƣợc trong nghiên cứu này sẽ cho ra nguồn quả thể nấm C. cicadae chất
lƣợng cao.
3.4. Ảnh hƣởng của dịch chiết quả thể nấm lên chuột nhắt trắng Swiss
3.4.1. Ảnh hƣởng của dịch chiết quả thể nấm lên sức sống và sự tăng trọng của chuột
Chuột nhắt trắng đực, chủng Swiss sau 4 tuần đƣợc cho uống dịch chiết nấm dƣợc liệu C. cicadae với liều uống là 250 µl/chuột/ngày, sức sống của chuột thí
nghiệm đƣợc thể hiện trong hình 3.15. Trong suốt q trình thực hiện thí nghiệm tất cả chuột đều biểu hiện bình thƣờng về hình thái, tập tính trong ăn, uống và các hoạt động khác (hình 3.16). Sau 4 tuần tác động dịch chiết nấm lên chuột, nhận thấy chuột ở các lơ thí nghiệm đều sống khỏe mạnh. Điều này cho thấy liều uống 250 µl/chuột/ngày tƣơng đƣơng khoảng 780 mg nấm C. cicadae/kg thể trọng là an toàn đối với chuột nhắt trắng đực, chủng Swiss. Nhƣ vậy, nấm C. cicadae không gây
nấm khô/kg thể trọng. Kết quả nghiên cứu này hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu của Holliday và Matt (2008) đã chứng minh nấm Cordyceps khơng có độc tố với
ngƣỡng rộng [31].
Hình 3.15. Sức sống của chuột sau 4 tuần thí nghiệm
Hình 3.16. Chuột ở các lơ thí nghiệm
Chúng tôi tiến hành đánh giá sựảnh hƣởng của dịch chiết quả thể nấm C. cicadaelên sự tăng trọng của chuột nhắt trắng Swiss thông qua trọng lƣợng của
nghiên cứu này chúng tôi không đánh giá tách biệt từng giai đoạn mà chỉ xem xét chung cho cả thí nghiệm. Từ kết quả thu đƣợc (hình 3.17) nhận thấy chuột ở hai nhóm cho uống dịch chiết quả thể nấm C. cicadae thể hiện sự tăng trọng cao hơn
chuột ở nhóm đối chứng (nhóm 3) và chuột ở nhóm 1 thể hiện sự tăng trọng cao nhất. Sự khác biệt giữa các nhóm có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Nhƣ vậy, dịch chiết nấm dƣợc liệu C. cicadaecó tác dụng kích thích sự tăng trọng của chuột nhắt trắng Swiss trong thời gian 4 tuần liên tiếp uống dịch chiết ở liều lƣợng 250 µl/chuột/ngày.
Hình 3.17. Sự tăng trọng của chuột sau 4 tuần thí nghiệm
3.4.2. Ảnh hƣởng của dịch chiết quả thể nấm lên thể lực của chuột
Ảnh hƣởng của dịch chiết quả thể nấm C. cicadae BG01lên thể lực của chuột nhắt trắng Swiss đƣợc tiến hành xác định thông qua thời gian bơi của chuột. Phƣơng pháp xác định khả năng bơi của chuột thƣờng đƣợc dùng khá phổ biến làm mơ hình để đánh giá tác dụng của các loại hoạt chất, thảo dƣợc đến thể lực của cơ thể [40]. Từ kết quả thí nghiệm (hình 3.18), chúng tơi nhận thấy thời gian bơi của chuột ở nhóm 1 và nhóm 2 đều dài hơn so với chuột ở nhóm 3 đối chứng. Chuột ở nhóm 1 có thời gian bơi trung bình cao hơn nhóm đối chứng 1,61 lần, nhƣng thấp
hơn so với nhóm 2. Chuột ở nhóm 2 có thời gian bơi trung bình cao hơn nhóm đối chứng 1,77 lần và cao hơn so với nhóm 1 là 1,1 lần. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Tỷ lệ tăng so với đối chứng lần lƣợt của nhóm 1 và 2 là 161,22%