Các thông số về thành phần của dung dịch siêu oxy hóaban đầu được thể hiển trong bảng 2.1.
Bảng 2. 1. Thành phần dung dịch supowa
STT Thông số Đơn vị Giá trị
1 pH - 6,5
2 ORP mV 900
3 TDS mg/L 1100
4 Chất oxy hóa (tính theo Clo dư) mg/L 728
Sau khi định lượng nồng độ chất oxy hóa (tính theo clo dư) trong dung dịch ban đầu rồi pha loãng đến nồng độ cần thiết đối với từng thí nghiệm, định lượng lại nồng độ chất oxy hóa trước khi thực hiện các thí nghiệm. Xác định nồng độ chất
oxy hóa đồng thời bằng cả hai phương pháp: phổ trắc quang với thuốc thử DPD của hãng HACH (Mỹ) và chuẩn độ iod theo SMEWW 4500- Cl B.
2.2. Phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện trong quy mơ phịng thí nghiệm:
- Các thơng số đánh giá về chất lượng rau: Tỷ lệ giảm khối lượng, tỷ lệ hư hỏng;
- Các chỉ số đánh giá về mức độ an toàn/diệt khuẩn: Coliforms, E.coli.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp tổng quan tài liệu
Thu thập, tổng hợp các tài liệu, các cơng trình nghiên cứu có liên quan đến vấn đề nghiên cứu trong và ngoài nước bao gồm:
- Rau vàmột số vi sinh vật gây bệnh trên rau; - Biện pháp khử trùng, bảo quản rau quả;
- Ứng dụng dung dịch hoạt hóa điện hóa trong sơ chế, bảo quản thực phẩm; Từ đó xác định các vấn đề, cũng như các thí nghiệm cần thiết cho việc tiến hành thực hiện các nội dung của luận văn.
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu trong phịng thí nghiệm
Để đáp ứng các mục tiêu đặt ra, các phương pháp nghiên cứu trong phịng thí nghiệm được tiến hành bao gồm:
Nghiên cứu nồng độ, thời gian thích hợp để khử trùng rau sống bằng supowa - Rau được thu hoạch cùng độ tuổi, sơ chế loại bỏ những rau bị tổn thương, dập nát, rửa nhẹ dưới vòi nước sạch.
- Nhúng rau trong nước có sẵn Coliforms(chủng Enterobacter aerogenes ATCC
35029, Microbiologics), E. coli(ATCC 25922, Microbiologics)và sau đó xác định
Nguồn vi khuẩn là các chủng ATCC, NCTC tiêu chuẩn quốc tế được cung cấp từ các hãng của Mỹ, Pháp, được nhân giống trong các môi trường đặc hiệu của hãng MERCK theo hướng dẫn của nhà cung cấp;Kỹ thuật nhân giống vi khuẩn được thực hiện theo hướng dẫn trong tài liệuCông nghệ vi sinh (Trần Thị Thanh, 2003): Cấy vi khuẩn giống đông khô trong môi trường thạch trên đĩa petri và nuôi ủ ở 370C trong 48 giờ. Thu sinh khối, định lượng mật độ vi khuẩn. Sau đó pha lỗng đến mật độ cần thí nghiệm.
Việc lựa chọn mật độ vi khuẩn nhúng rau dựa vào hàm lượng thực tế Coliforms và E.coli trên rau thường là 106-108 cfu/g. Sau khi khử trùng rau bằng các phương pháp khác nhau, giá trị Coliforms còn lại trên rau nhỏ hơn 104 cfu/g và
E.coli là nhỏ hơn 103cfu/g sẽ đạt QCVN 8-3:2012/BYT - Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia đối với ô nhiễm vi sinh vật trong thực phẩm.
- Các mẫu được rửa bằng các dung dịch rửa(NaClO, supowa, nước sạch) theo các nồng độ và thời gian khác nhau. Việc lựa chọn nồng độ supowa dựa trên hàm lượng NaClO khuyến cáo sử dụng trong công nghiệp thực phẩm là nhỏ hơn 200 ppm. Trong công nghiệp thực phẩm, việc sử dụng dung dịch khử trùng với nồng độ không cao và thời gian rửa rau ngắn sẽ đem lại lợi ích kinh tế cao. Chính vì vậy, thời gian nghiên cứu lựa chọn là 1, 2, 4 phút với nồng độ chất khử trùng nhỏ hơn 200 ppm. Dung dịch supowa đã được định lượng lại nồng độ chất oxy hóa (tính theo Clo dư) bằng cả hai phương pháp: phổ trắc quang với thuốc thử DPD của hãng HACH (Mỹ) và chuẩn độ iod theo SMEWW 4500- Cl B có nồng độ lần lượt là 9,9; 24,7; 49,9; 99,8, 150, 1; 200 ppm.
- Xác địnhcoliforms trên rau sau khi khử trùng bằng phương pháp TCVN 6848:2007 (ISO 4832:2007): Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Phương pháp định lượng Coliforms – Kỹ thuật đếm khuẩn lạc.
- Xác định E. coli trên rau theo ISO 9308-1 (2014) và hướng dẫn của nhà sản xuất hóa chất (MERCK) Microbiology Chromocult: hòa tan 26,5 g Chromocult trong 1 lit nước, lắc đều rồi đun sôi cho đến khi tan hết, không cần hấp. Giữ môi trường ở
45-50oC trong bể ổn nhiệt, pH bằng 6,8±0,2 ở 25oC. Nuôi cấy vi khuẩn trên đĩa thạch trong 21 ± 3 h ở 36 ± 2°C. Trên đĩa thạchE. colisẽ có màu tím.
Tồn bộ thí nghiệm được lặp lại 3 lần, thí nghiệm được tóm tắt trong hình2.4.
Hình 2. 4. Sơ đồ thí nghiệm nghiên cứu nồng độ và thời gian khử trùng
Nghiên cứu việc bảo quản rau sau khử trùng ở điều kiện tủ lạnh và điều kiện thường.
Rau sau khi thu hoạch được sơ chế và rửa lại bằng nước máy. Rau được chia làm các phần bằng nhau và ngâm vào dung dịch supowa với các nồng độ chất oxy hóa lần lượt là 10, 50, 100, 150 ppm trong thời gian 4 phút. Sau khi ngâm rau được vớt ra rửa lại dưới vòi nước RO tiệt trùng rồi để ráo và bảo quản trong túi. Rau được
Sơ chế rau
Ngâm trong dung dịch chứa Coliforms hoặc
E.coli khoảng 106 -107 Xác địnhcoliforms,
E.coli
Rửa rau bằng nước sạch.
Nhúng rau vào supowa có nồng độ chất oxy hóa là9,9; 24,7; 49,9; 99,8, 150, 1; 200 ppm trong 1, 2, 4 phút.
Xác định coliforms,
E.coli
Nhúngrau vào Javen có nồng độ chất oxy hóa là 9,9; 24,7; 49,9; 99,8; 150,1 ; 200 ppm trong 1, 2, 4 phút .
Rửa lại bằng nước RO vô trùng
Xác định coliforms, E.coli Xác định coliforms, E.coli
Rửa lại bằng nước RO vơ trùng
bảo quản trong phịng (nhiệt độ khoảng 26oC) và trong tủ mát (nhiệt độ khoảng 5oC). Hàng ngày quan sát và đánh giá các chỉ tiêu:
+ Tỷ lệ hư hỏng (%);
+ Thời gian xuất hiện triệu chứng hư hỏng (ngày): Được tính từ khi bắt đầu thí nghiệm đến khi quan sát thấy rau bị hư hỏng do đổi màu, do héo, dập nát, lõi biến màu;
+ Đánh giá chất lượng cảm quan;
+ Xác định tỷ lệ hao hụt trọng lượng bằng cách dùng cân để xác định khối lượng mẫu ban đầu và xác định khối lượng cho những lần theo dõi sau, tính tỷ lệ giảm khối lượng. Tỷ lệ hao hụt khối lượng được tính theo cơng thức 2.2:
∆m(%)= {(md-ms)/md}*100 (2.2)
Trong đó: md: khối lượng đầu (g) ms: khối lượng sau (g)
Tóm tắt thí nghiệm được trình bày trong hình2.5.
Hình 2. 5. Sơ đồ thí nghiệm bảo quản rau
Bảo quản ở 5oC
Sơ chế rau, rửa bằng nước máy
Ngâm trong supowa 9,9; 24,7; 49,9; 99,9; 150,1 ppm
Rửa lại bằng nước RO, để ráo nước Không rửa lại, để ráo nước
Bảo quản ở nhiệt độ 26oC phòng
Bảo quản ở nhiệt độ 26oC
phòng
Bảo quản ở 5oC
+ Cân xác định sự thay đổi trọng lượng mẫu. + Hàng ngày quan sát, đánh giá chụp ảnh mẫu
Nghiên cứu khả năng lưu trữ và sự thay đổi chất lượng nước siêu oxy hóa trong q trình lưu trữ.
Supowa mới sinh ra được kiểm tra các thông số pH, ORP, TDS, nồng độ chất oxy hóa. Sau đó supowa được lưu cho đầy vào bình đựng B110 lít có diện tích mặt thống 1256 cm2, có nắp kín đậy lại. Tương tự đối với bình đựng B2được lấy 10 lít cho vào bìnhcó diện tích mặt thống 50 cm2và đậy kín. Cả hai bình được để trong trong phịng, thống và khơ ráo. Thí nghiệm theo dõi supowa lưu trữ ở bình B1 và ở B2 được tiến hành song song với nhau, các điều kiện làm thí nghiệm như nhau. Sau các khoảng thời gian là: 2, 4, 8, 24, 48, 72, 96 giờ lấy mẫu đo đạc các thơng số pH, ORP, TDS và phân tích nồng độ chất oxy hóa. Mỗi thí nghiệm được làm lặp lại 3 lần, sau đó lấy giá trị trung bình của 3 lần đo.
Tồn bộ thí nghiệm của đề tài được thực hiện tại Viện Công nghệ môi trường, sử dụng các máy móc thiết bị hiện đại và hóa chất chính thể hiện trong bảng 2.2:
Bảng 2. 2. Danh mục thiết bị và hóa chất chính
Stt Tên thiết bị, hóa chất Hãng sản xuất
I Thiết bị
1. Máy đo pH và ORP HANNA HI991002 Italia
2. UVVis Labomed UV- 3200 Labomed - USA
3. Máy đo DR 2800 HACH
4. Tủ cấy Vi sinh
SW-EJ- 1FD Trung Quốc
5. Nồi hấp tiết trùng DAIHAN
Scientific Hàn Quốc
6. Bể ổn nhiệt Grant
GLS 400 England
7. Tủ ấm lạnh ủ mẫu Velp FOC 120E
Scientifica EUROPE
II Hóa chất
1. Chủng chuẩn Coliforms(chủng Enterobacter
aerogenes ATCC 35029, Microbiologics), Mỹ
2. Chủng chuẩn E. coli(ATCC 25922,
Microbiologics) Mỹ
3. Microbiology Chromocult Merck (Đức)
4. Thạch lactoza mật đỏ trung tính tím tinh thể
(Violet Red Bile Agar) Himedia
5. Canh thang mật lactoza lục sáng Merck (Đức)
6. NaClO Merck (Đức)
2.3.3. Phương pháp xử lý số liệu
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ dung dịch siêu oxy hóa và thời gian khử trùng đến hiệu quả khử trùng khử trùng đến hiệu quả khử trùng
Rau mới cắt được mang về phịng thí nghiệm sơ chế và đem đi xét nghiệm vi sinh vật. Kết quả cho thấy lượng Coliforms trên rau xà lách và rau cải nằm trong khoảng 103-104 CFU/g, hàm lượng E. coli khoảng 102 CFU/g. Vì rau làm thí nghiệm được cung cấp bởi các đơn vị trồng theo tiêu chuẩn VietGAP nên rau khi ban đầuđã có Coliforms và E. coli đạt QCVN 08-3:2012/BYT về chất lượng rau ăn sống. Tại các nhà ăn của các Trường Đại học ở Tây Ban nha, lượng Coliforms tìm thấy trên rau diếp cũng nằm trong khoảng từ 101-104 MPN/g [12]. Để khẳng định hiệu quả khử trùng của dung dịch supowa trên rau xà lách và rau cải khơng chỉ với rau VietGAP mà cịn các loại rau khác, trong nghiên cứu này tác giả bổ sung thêm Coliforms và E.coli lên rau bằng cách ngâm rau vào dung dịch có Colifroms 107-108 CFU/g và E.coli105-106 CFU/gtrước khi khử trùng[30].
3.1.1. Hiệu quả khử trùng Coliforms trên rau xà lách và rau cải
Rau sau khi được bổ sung Coliforms và E. coli được ngâm trong các dung dịch rửa (nước sạch, supowa, javen) ở các nồng độ và thời gian khác nhau. Mật độ coliforms trên rau xà lách và rau cải trong các thí nghiệm lần lượt là 6x107 và 8x107.Kết quả nghiên cứu hiệu lực khử trùng Coliforms của dung dịch supowavà javen trên rau cải và rau xà lách được thể hiện trong bảng 3.1, 3.2, 3.3, 3.4.
Bảng 3. 1. Kết quả sử dụng javen khử trùng Coliforms trên rau xà lách
(đơn vị CFU/g)
Dung dịch Nƣớc máy Javen (9,9 ppm) Javen (24,7 ppm) Javen (49,9 ppm) Javen (99,9 ppm) Javen 150,1( ppm) Javen (200 ppm) Sau ngâm 1 phút 4x107 3x107 1x107 9x106 7x106 3x106 1x106 Sau ngâm 2 phút 4x107 8x106 4x106 1x106 9x105 7x105 6x105 Sau ngâm 4 phút 3x10 7 1x106 8x105 3x105 7x104 3x104 1x104
Sau khi bổ sung Coliforms lên rau cải và rau xà lách, hàm lượng Coliforms ban đầu trên rau khoảng 107 CFU/g. Từ bảng 3.1 cho thấy, với Javen nồng độ chất oxy hóa là 9,9 mg/l sau 1 phút chỉ giảm được 0,3 log CFU/g Coliforms gần như không đáng kể, khi kéo dài thời gian khử trùng lên 4 phút thì Coliforms cũng chỉ giảm được 0,7 log CFU/g.Trong khi nếu sử dụng dung dịch javen 200 ppm trong 1 phút thì giảm được 1,8 log CFU/g Coliforms, sau 4 phút Coliforms giảm được 3,8 log CFU/g Coliforms, tuy nhiên lượng Coliforms vẫn chưa đạt yêu cầu.
Thời gian khử trùng là 1 phút, nồng độ Javen tăng từ 9,9 ppm lên 200 ppm, cho thấy lượng Coliforms giảm được là 1,6 log CFU/g. Cùng 2 nồng độ trên, khi tăng thời gian lên 4 phút, thì hiệu quả khử trùng rõ rệt hơn, Coliforms giảm được 3,5 log CFU/g.
Bảng 3. 2. Kết quả sử dụng supowa khử trùng Coliforms trên rau xà lách
(đơn vị CFU/g) Dung dịch Nƣớc máy Supowa (9,9 ppm) Supowa (24,7 ppm) Supowa (49,9 ppm) Supowa (99,9 ppm) Supowa (150,1p pm) Supowa (200 ppm) Sau ngâm 1 phút 4x107 4x106 3x106 1x106 8x105 7x105 5x105 Sau ngâm 2 phút 4x10 7 1x105 9x105 7x105 4x105 3x105 1x105 Sau ngâm 4 phút 3x107 8x104 6x104 3x104 9x103 8x103 5x103
Từ bảng 3.2 cho thấy khi sử dụng nước máy việc loại bỏ Coliforms là không đáng kể, sau 4 phút ngâm chỉ loại bỏ được 0,3 log CFU/g Coliforms.Kết quả khử trùng Coliforms trên rau xà lách bằng dung dịch supowa cho thấy hiệu quả tốt hơn so với dung dịch javen và nước sạch. Với cùng nồng độ 9,9 ppm, trong thời gian4 phút, dung dịch supowa giảm được 3 log CFU/g Coliforms trong khi javen chỉ giảm được 1 log CFU/g. Phải đến khi tăng nồng độ clo lên 99,9 ppmvới thời gian ngâm là 4 phút thì javen mới giảm được 3 log CFU/g Coliforms, supowa đã giảm được 4 log CFU/g. Khi tăng nồng độ supowa từ 150 ppm lên 200 mg/l, cho thấy các kết quả khử trùng không thay đổi nhiều.
So sánh với kết quả nghiên cứu khử trùng Coliforms bằng tia UV (254nm) lượng dùng là 8,14 kJ/m2 trên rau xà lách lô lô giảm được 0,6 log CFU/g Coliforms [48], cho thấy việc sử dụng dung dịch supowa đem lại hiệu quả khử trùng cao hơn hẳn.
Bảng 3. 3. Kết quả sử dụng javen khử trùng Coliforms trên rau cải
(đơn vị CFU/g) Dung dịch Nƣớc máy Javen (9,9 ppm) Javen (24,7 ppm) Javen (49,9 ppm) Javen (99,9 ppm) Javen 150,1p pm) Javen (200 ppm) Sau ngâm 1 phút 4x106 2x107 9x106 8x106 2x106 9x105 7x105 Sau ngâm 2 phút 6x106 8x106 4x106 1x106 4x105 1x105 5x104 Sau ngâm 4 phút 7x106 1x106 7x105 3x105 6x104 1x103 9x103 Kết quả nghiên cứu việc sử dụng javen để khử trùng Coliforms trên rau cải cũng tương tự như đối với rau xà lách. Với cùng nồng độ là 9,9 ppm nhưng thời gian khử trùng là 1 phút thì lượng coliforms giảm là 0,6 log CFU/g, sau 4 phút là 1,6 log CFU/g. Với javen 200 ppm, thời gian khử trùng là 1 phút thì giảm được 2,1 log CFU/g Coliforms, sau 4 phút giảm được 2,9 CFU/g Coliforms.
Bảng 3. 4. Kết quả sử dụng supowa khử trùng Coliforms trên rau cải (đơn vị CFU/g) (đơn vị CFU/g) Dung dịch Nƣớc máy Supowa (9,9 ppm) Supowa (24,7 ppm) Supowa (49,9 ppm) Supowa (99,9 ppm) Supowa (150,1 ppm) Supowa (200 ppm) Sau ngâm 1 phút 4x106 4x106 9x105 8x105 6x105 5x105 3x105 Sau ngâm 2 phút 6x106 5x105 3x105 8x104 5x104 8x103 7x103 Sau ngâm 4 phút 7x106 9x104 3x104 1x104 6x103 4x103 2x103 Nghiên cứu trên rau cải cũng cho kết quả tương tự như đối với rau xà lách tuy nhiên do rau xà lách lơ lơ xanh có nhiều tàu lá xếp lên nhau lên việc tiếp xúc giữa dung dịch với toàn bộ lá là không tốt như đối với rau cải, dẫn đến hiệu quả khử trùng trên rau cải là tốt hơn. Dung dịch supowa có hiệu quả khử trùng tốt hơn dung dịch javen. Ở cùng nồng độ chất oxy hóa là 99,9 ppm, sau thời gian khử trùng là 4 phút, javen giảm được 3,1 log CFU/g Coliform, tuy nhiên hàm lượng Coliforms trên rau vẫn còn là 6x104 nên chưa đạt tiêu chuẩn. Trong khi đó, supowa giảm được 4,1 log CFU/g Coliform, lúc này hàm lượng Coliforms đã đạt tiêu chuẩn.
Việc khử trùng với thời gian 4 phút và với dung dịch có nồng độ cao nhưng lượng Coliforms khơng thay đổi nhiều có thể do khi ngâm vi sinh vật vào rau, có một lượng Coliforms xâm nhập vào bên trong tế bào rau. Việc khử trùng rau chỉ có tác dụng trên bề mặt rau, không thể thâm nhập vào bên trong tế bào rau nên không diệt được toàn bộ vi sinh vật. Nguyên nhân này cũng được Guentzel và cộng sự (2008) chỉ ra trong nghiên cứu của họ, số lượng vi khuẩn sống sót trên rau cải có thể là do thời gian tiếp xúc không đủ, đặc điểm cấu trúc của bề mặt rau (bề mặt mịn và thô) và các cơ chế bảo vệ khác nhau của màng gắn kếtvi khuẩn [24].
Hiệu quả khử trùng của dung dịch siêu oxy hóa trên rau có thể giải thích bởi thế oxy hóa khử của supowa là 900 mV. Do giá trị ORP tối ưu của vi sinh vật hiếu
khí là +200 đến + 800 mV, của vi sinh vật kỵ khí là -30 đến -550 mV. Có cơ chế giống như dung dịch SAEW, dung dịch supowa làm bất hoạt một enzyme của vi khuẩn và tăng độ thấm của màng tế bào. Do đó, có thể gây ra sự gia tăng độ dẫn và