Aeruginosa trên thế giới

Sự gia tăng tính k háng kháng sinh trong nhiễm khuẩn P. aeruginosa là vấn

đề đáng lo nga ̣i đối với sức khoẻ cộng đồng toàn cầu, đặt ra nhiều thách thức về mặt điều trị. Đặc biệt, những năm gần đây đã có nhiều phát hiện quan trọng về khả năng thích ứng của loại vi khuẩn này nhằm kháng lại các loại kháng sinh, điều này cho thấy loại vi khuẩn này là một mối đe dọa đến thời đại kháng sinh hiện nay của

chúng ta. Ngoài ra , đã có nhiều báo cáo về sự xuất hiện của các chủng P. aeruginosa có khả năng kháng lại nhiều kháng sinh, do vậy cần phải giám sát chặt

chẽ và nhanh chóng đưa ra các hành động cụ thể nhằm ngăn chặn sự lây lan của vi khuẩn này trên hệ thống y tế toàn thế giới.

Theo báo cáo của hệ thống giám sát nhiễm khuẩn bệnh viện quốc gia tại Mỹ,

P. aeruginosa đứng thứ hai trong số các tác nhân gây nhiễm trùng bệnh viện liên quan đến bệnh viêm phổi. Tỷ lệ ca nhiễm khuẩn bệnh viện do P. aeruginosa gây ra đã tăng dần trong những năm gần đây trên thế giới. Cùng với sự gia tăng về tỷ lệ nhiễm khuẩn là sự gia tăng về khả năng kháng kháng sinh. Tốc độ xuất hiê ̣n khả năng kháng của vi khuẩn này với các nhóm kháng sinh cũng tăng nhanh và lan rộng ở hầu hết các cơ sở y tế trên toàn cầu. Theo dữ liệu từ các nước châu Âu, bao gồm hệ thống giám sát kháng kháng sinh (EARSS, hiện nay là EARS-Net), cho thấy xu hướng ngày càng tăng về tỷ lệ kháng carbapenem của chủng P. aeruginosa thay đổi từ 4,4% đến 58,5% giữa các nhóm quốc gia khác nhau. Tại Litva, tỷ lệ nhiễm các chủng kháng carbapenem cũng tăng từ 21% lên 29% trong giai đoạn 2006-2014 [47]. Theo báo cáo mới nhất của CDC Hoa Kỳ, ước tính có hơn hai triệu người bị bệnh mỗi năm, ít nhất 23.000 người chết do vi khuẩn kháng kháng sinh và có khoảng 51.000 ca nhiễm bệnh liên quan đến P. aeruginosa. Trong đó, hơn 6.000 ca (13%) là đa kháng thuốc, với khoảng 400 ca tử vong do nhiễm trùng [24]. Tại Vương quốc Anh, theo nghiên cứu của Pitt TL vào năm 2003, cho thấy 50% số chủng P. aeruginosa kháng gentamicin, 39% kháng ceftazidime, 32% kháng

piperacillin và 30% kháng ciprofloxacin [82]. Trong công bố của Sheetal Sharma vào năm 2016, tỉ lệ P. aeruginosa kháng với ciprofloxacin, ceftriaxone, piperacillin, cefoperazone tương ứng là 31,74%; 76,6%; 53,96%; 36,5% [98].

Sự nổi lên của các chủng MDR P. aeruginosa thường xảy ra ở bệnh nhân điều tri ̣ ta ̣i các Khoa hồi sức tích cực (ICU). Manian và cộng sự đã phân tích tỷ lệ kháng thuốc giữa các chủng P. aeruginosa được phân lập từ ICU, thấy rằng tỷ lệ

kháng penicillin và cephalosporin thường liên quan đến việc trước đó bệnh nhân đã điều trị với cephalosporin thế hệ thứ ba [63]. Nhìn chung, tỷ lệ vi khuẩn MDR ở

châu Âu là 5%, châu Á và Mỹ là 2%, trong khi tỷ lệ này ở Mỹ Latinh thường >8%. Một nghiên cứu về sự đề kháng của P. aeruginosa đối với kháng sinh β-lactam cho thấy, bệnh nhân điểu tri ̣ ta ̣i ICU có nguy kháng cao với imipenem, piperacillin/tazobactam và cefotaxime. Theo nguồn dữ liệu thu thập được từ các chủng P. aeruginosa phân lập từ bệnh nhân tại các ICU ở châu Âu từ năm 1990 đến năm 1999, tỷ lệ vi khuẩn MDR tương đối cao, như kháng ceftaidime đạt 57%, kháng aminoglycoside đạt 37-70%, kháng imipenem đạt 52%, kháng ciprofloxacin đạt 56% và kháng piperacillin/tazobactam đạt 53% [91]. Theo báo cáo đã được công bố của Hệ thống Giám sát Nhiễm trùng Hoa Kỳ (NNIS) năm 2004, tỷ lệ kháng của P. aeruginosa đối với quinolone ở mức 29,5% và imipenem ở mức 21,1%.

Trong các chủng phân lập đươ ̣c ta ̣i ICU, tỷ lệ kháng thuốc thậm chí cịn tăng lên đến 23,6% đối với ceftazydime, 31,4% đối với piperacillin/tazobactam, 38% đối với imipenem và 51,6% đối với ciprofloxacin [104].

1.2.6.2 Tình hình kháng kháng sinh của P. aeruginosa ở Việt Nam

Ở Việt Nam, dưới tác động của công cuộc đổi mới kinh tế vào đầu những thập niên 1990 đã dẫn tới sự bùng nổ của các nhà thuốc tư nhân, các thuốc kháng sinh có thể mua dễ dàng khơng cần đơn thuốc hay chỉ định của bác sỹ, điều này dẫn tới việc sử dụng không đúng và lạm dụng kháng sinh ở Việt Nam. Đây là những yếu tố nguy cơ quan trọng dẫn đến tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn ở Việt Nam.

Hiện nay, khi bệnh truyền nhiễm vẫn chiếm một tỷ lệ lớn trong mơ hình bệnh tật thì việc sử dụng kháng sinh một cách hiệu quả đóng một vai trị quan trọng trong việc giảm tỷ lệ mắc và tử vong do các bệnh nhiễm khuẩn. Tuy nhiên sự gia tăng tình trạng vi khuẩn kháng kháng sinh sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng đến đến sức khỏe của người dân cũng như tổn thất về kinh tế.

Ở khu vực miền Nam, tác giả Hồng Dỗn Cảnh, Vũ Lê Ngọc Lan và cộng sự đã tiến hành khảo sát tỷ lệ kháng kháng sinh và xác định khả năng sản xuất carbapenemase từ 28 chủng P. aeruginosa phân lập được từ các mẫu bệnh phẩm tại Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh. Kết quả cho thấy có 48,2% bệnh nhân nhiễm P. aeruginosa là những bệnh nhân lớn tuổi, chủ yếu từ 50 tuổi trở lên. P. aeruginosa

kháng lại với hầu hết các kháng sinh với tỷ lệ khá cao (trên 40%), đặc biệt là tỷ lệ kháng khá cao với imipenem (46,2%). Chỉ một tỷ lệ nhỏ kháng lại colistin (10,7%) và 17,9% số chủng P. aeruginosa có khả năng sản xuất carbapenemase kháng lại

các kháng sinh thuộc nhóm carbapenem [1]. Theo nghiên cứu của Nguyễn Sỹ Tuấn và cộng sự tại bệnh viện đa khoa thống nhất Đồng Nai cho thấy P. aeruginosa đã kháng trên 50% với hầu hết các kháng sinh, trừ colistin, cefoperazone/sulbactam, piperacillin/tazobactam [11]. Ở Miền Bắc theo nghiên cứu của tác giả Nguyễn Phú Hương Lan và cộng sự năm 2010 về mức độ kháng kháng sinh của P. aeruginosa tại Bệnh viên Nhiệt Đới cho thấy ở các loại mẫu khác nhau vi khuẩn này có tỉ lệ kháng kháng sinh khác nhau. Cụ thể đối với các chủng P. aeruginosa phân lập được từ dịch hút khí quản tỉ lệ kháng với các kháng sinh là từ 18-32% trong đó cefatazidin là 31%, ciprofloxacin là 28%, piperacillin/tazobactam là 31%, amikacin là 25%, trừ imipenem và meropenem còn tương đối thấp là 4,1% và 1,4%. Trong khi đó các mẫu cấy máu dương tính với P. aeruginosa vẫn cịn nhạy với các kháng sinh thường dùng. Các kháng sinh như cefatazidin, ciprofloxacin, amikacin đều nhạy cảm hoàn toàn với các chủng P. aeruginosa gây nhiễm trùng huyết [8]. Một nghiên cứu ở 36 bệnh viện các tỉnh phía Bắc trong năm 2006–2007 bao gồm 2 bệnh viện Trung ương, 17 bệnh viện tuyến tỉnh, 17 bệnh viện tuyến huyện cho thấy 553/7571 (7,8%) bệnh nhân bị nhiễm trùng bệnh viện. Có 3 loại nhiễm khuẩn chính: viêm phổi (41,9%), nhiễm khuẩn vết mổ (27,5%), nhiễm khuẩn tiêu hóa (13,1%). Căn ngun chính là A. baumannii (23,3%) và P. aeruginosa (31,5%) [7]. Theo kết quả nghiên cứu từ 4 bệnh viện tại Hà Nội: Việt Đức, Xanh Pôn, Bệnh viện 108 và Bệnh viện 103 từ năm 2005 -2008 cho thấy P. aeruginosa phân lập từ các bệnh phẩm đề kháng rất cao với các loại kháng sinh như tetracycline (92,1%), ceftriaxone (58,5%) và gentamicin (54%) [3].

1.2.7 Các kĩ thuật thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh của P. aeruginosa 1.2.7.1 Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán trên thạch 1.2.7.1 Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán trên thạch

Nguyên lý: kháng sinh trong khoanh giấy sẽ khuếch tán vào thạch Mueller- hinton đã cấy các chủng vi khuẩn thử nghiệm. Mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với

kháng sinh được biểu hiện bằng đường kính các vịng vơ khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh [32]. Tuy nhiên kỹ thuật là chỉ phát hiện được mức độ nhạy cảm nồng độ kháng sinh đã biết trước, nhưng đây là kỹ thuật đơn giản và giá thành rẻ nên hiện vẫn được sử dụng phổ biến tại các quốc gia đang phát triển để điều trị và giám sát dịch tễ học.

1.2.7.2 Kỹ thuật xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)

Nguyên lý: Các chủng vi khuẩn thử nghiệm được nuôi cấy trên các đĩa thạch Mueller-hinton hoặc canh thang có chứa nồng độ kháng sinh khác nhau. Nồng độ kháng sinh tối thiểu có tác dụng ức chế vi khuẩn được xác định khi mật độ khuẩn lạc ≤3. Đây là kỹ thuật chuẩn thức được áp dụng nhằm xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế sự phát triển của vi khuẩn, kết quả giúp các bác sỹ lựa chọn và tính tốn liều kháng sinh cho bệnh nhân [23]. Tuy nhiên kỹ thuật này có giá thành cao, phức tạp, đầy đủ trang thiết bị và cán bộ có kinh nghiệm để thực hiện.

1.2.7.3 Kỹ thuật E-test

Kỹ thuật E-test được sử dụng rộng rãi tại các quốc gia phát triển. Thanh giấy kháng sinh E-test chứa các phổ kháng sinh có các nồng độ kháng sinh khác nhau được đặt lên đĩa thạch đã được trải huyền dịch vi khuẩn, khả năng ức chế vi khuẩn ở nồng độ thấp nhất sẽ được phát hiện ở phổ kháng sinh (điểm gãy) dựa vào đó các bác sỹ có thể tính tốn liều điều trị phù hợp cho bệnh nhân [23].

1.2.8 Các kĩ thuật sinh học phân tử xác định kiểu gen của P. aeruginosa 1.2.8.1 Kĩ thuật RAPD-PCR (Random amplified polymorphic ADN 1.2.8.1 Kĩ thuật RAPD-PCR (Random amplified polymorphic ADN fingerprinting)

Đây là phương pháp đơn giản xác định nhanh chóng kiểu hình của các loại vi khuẩn. Nguyên lý: sử dụng các đoạn mồi ngẫu nhiên đơn có kích thước ngắn khoảng 10 nucleotide, qua chu trình nhiệt của phản ứng PCR các đoạn mồi này có thể gắn vào nhiều vị trí khác nhau của ADN để khuếch đại ngẫu nhiên các đoạn gen của vi khuẩn có kích thước từ 100-1000bp. Dựa vào sự khác nhau của các đoạn ADN của các chủng có thể so sánh mối liên quan của các chủng vi khuẩn trong các nghiên cứu dịch tễ học [88]. RAPD-PCR là kỹ thuật đơn giản, có khả năng phân

loại nhanh và tốt hơn so với phương pháp phân loại kinh điển, tuy nhiên kỹ thuật này chỉ định loại được vi khuẩn ở mức độ giới hạn khi so sánh với kỹ thuật PFGE.

1.2.8.2 Kĩ thuật điện di xung trƣờng (PFGE)

Nguyên lý: Kỹ thuật được sử dụng để phân loại và xác định nguồn gốc của các loại vi khuẩn. Kỹ thuật này sử dụng những enzym giới hạn phù hợp để cắt ADN nhiễm sắc thể thành những phân đoạn không đều (10 đến 30 vạch ADN), các phân đoạn ADN này sẽ được điện di để phân tách các phân đoạn từ 1kb đến 1000kb. Q trình phân tích dựa trên sự so sánh các đoạn ADN của các chủng vi khuẩn để xác định mối liên quan và nguồn gốc của các chủng vi khuẩn ở các vùng và thời gian khác nhau. PFGE là kỹ thuật sinh học phân tử được các nhà khoa học sử dụng để nghiên cứu và đánh giá sự lây truyền của các vi khuẩn gây bệnh trong bệnh viện và cộng đồng. Ở Việt Nam, kỹ thuật PFGE được sử dụng để phân tích mối liên hệ về kiểu gen của các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh như phân tích mối liên hệ về kiểu gen của các chủng vi khuẩn Gram âm kháng đa kháng sinh [107].

1.2.8.3 Kĩ thuật phân loại trình tự đa vị trí (Multi Locus Sequence Typing-MLST) MLST)

Kỹ thuật phân loại trình tự đa vị trí (MLST) được đánh giá kỹ thuật tốt để phân loại kiểu gen của nhiều loại vi khuẩn như: Streptococcus pneumoniae, S. aureus và A. baumannii. Nguyên lý của kỹ thuật này là dựa vào các trình tự gen của

các vùng bảo tồn của 7 loại gen giữ nhà của từng loại vi khuẩn để phân loại kiểu gen của vi khuẩn. Ví dụ, Gomila và cộng sự đã sử dụng kĩ thuật này để phân loại trình tự gen của P. aeruginosa dựa trên 7 vùng gen bảo tồn bao gồm: acsA (Acetyl

coenzym A synthetase), aroE (Shikimate dehydrogenase), guaA (GMP synthase), mutL (DNA mismatch repair protein), nuoD (NADH dehydrogenase I chain C, D), ppsA (Phosphoenolpyruvate synthase) và trpE (Anthralite synthetase component I)

[40]. Kỹ thuật MLST được đánh giá để phân loại kiểu gen tốt hơn kỹ thuật PFGE và là một trong rất ít các kỹ thuật được gọi là ―thư viện‖ để xắp xếp, phân loại và được sử dụng trong các nghiên cứu dịch tễ học của các chủng vi khuẩn, qua đó có thể xác

định các chủng gây dịch, kháng kháng sinh, hay sinh độc tố nhằm giám sát sự lây truyền của chúng trong phạm vi quốc gia và trên thế giới.

1.2.8.4 Kĩ thuật giải trình tự gen

Đây là kỹ thuật được sử dụng rộng rãi để giải trình tự các gen kháng kháng sinh, đặc biệt là phân tích các plasmid mang gen kháng kháng sinhcủa vi khuẩn. Đây là phương pháp chính xác nhất để xác định các đặc tính kháng kháng sinh của vi khuẩn.

Phương pháp giải trình tự gen của Sanger bằng điện di mao quản vẫn luôn được coi là chuẩn vàng trong các phương pháp giải trình tự gen hiện nay. Trong lĩnh vực nghiên cứu về kháng kháng sinh, phương pháp này chủ yếu được sử dụng để giải trình tự các gen kháng vì các gen này thường có kích thước < 2 kb. Tuy nhiên với nhu cầu tìm hiểu cấu trúc của các yếu tố di truyền di động (4 ~ 10 kb) hay các plasmid mang gen kháng có kích thước từ vài chục đến hàng trăm kb thì phương pháp này lại khơng đáp ứng được.

Hiện nay, đã có nhiều bước đột phá trong kỹ thuật giải trình tự gen như kỹ thuật ―next-generation sequencing‖ với đỉnh cao là phương pháp Whole Genome Sequence - WGS cho phép giải trình tự tồn bộ hệ gen của vi khuẩn một cách nhanh chóng trong một lần giải mã so với hệ thống giải mã trình tự cũ (chỉ giải mã được 35-700bp). Đây là kỹ thuật hữu hiệu để nghiên cứu dịch tễ học cũng như các đặc tính sinh học phân tử, độc tố hay các đặc tính kháng kháng sinh của vi khuẩn. Qua đó có thể đưa ra các biện pháp phịng chống vi khuẩn kháng kháng sinh một cách có hiệu quả.

1.3 Tính mới, tính thời sự và ý nghĩa khoa học của nghiên cứu

P. aeruginosa là một trong số những tác nhân nhiễm khuẩn bệnh viện hàng

đầu và cực kì nguy hiểm do mức độ đề kháng kháng sinh mạnh. Có nhiều cơ chế kháng kháng sinh đã được tìm thấy ở P. aeruginosa. Đặc biệt, hệ genome của P. aeruginosa nằm trong số những vi khuẩn có kích thước hệ gen lớn nhất với 6,26

Mbp chứa khoảng 5567 gen, cộng thêm một số lượng lớn các gen có thể được truyền ngang giữa các vi khuẩn làm cho vi khuẩn này có khả năng thích nghi rất cao

với những biến động của môi trường bao gồm áp lực do kháng sinh. Do vậy, P. aeruginosa được tổ chức Y tế thế giới xếp vào nhóm vi khuẩn ưu tiên số 1 trong

giai đoạn hiện nay.

Việt Nam nằm trong khu vực châu Á được xem là "điểm nóng" của vi khuẩn kháng kháng sinh. Nhận thức sâu sắc được tầm quan trọng vấn đề này, trong những năm vừa qua, Bộ Y tế cùng các ban ngành liên quan đang phối hợp triển khai các hoạt động phòng chống vi khuẩn kháng kháng sinh, tích cực tham gia vào các hoạt động phòng chống vi khuẩn kháng kháng sinh với các tổ chức, quốc gia trên thế giới như Liên Hiệp Quốc (2016), nhóm G20 (2017), các quốc gia ASEAN (2017).

P. aeruginosa là căn nguyên thường gặp gây nhiễm khuẩn bệnh viện ở Việt Nam và

đã kháng lại kháng sinh trong các bệnh viện ở mức độ cao. Ở Việt Nam, phần lớn các nghiên cứu chỉ tập trung vào tỷ lệ kháng kháng sinh/ đa kháng kháng sinh của

P. aeruginosa, chưa có nhiều nghiên cứu sâu về kiểu gen, xác định nguồn gốc để

đánh giá khả năng lây lan của các chủng P. aeruginosa trong bệnh viện. Có thể kể đến nghiên cứu sâu về hệ gen của Tada và cộng sự trên một số chủng P. aeruginosa phân lập tại bệnh viện Bạch Mai. Tuy nhiên nghiên cứu này không được thực hiện tại Việt Nam mà được tiến hành tại phịng thí nghiệm ở các quốc gia đang phát triển [114].

Tính đa kháng kháng sinh của P. aeruginosa đã gây ra nhiều khó khăn trong q trình điều trị các ca bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn này gây ra cũng như làm tăng tỉ lệ bệnh tật, tăng tỉ lệ tử vong và tăng chi phí điều trị. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu ở các mức độ khác nhau, từ các phương pháp truyền thống tới các kĩ thuật sinh học phân tử chuyên sâu để đánh giá tình trạng kháng kháng sinh, đặc