2.3.1.2 Đọc và phân tích kết quả
Trước tiên đọc kết quả ở các đĩa thạch chứng khơng có kháng sinh để kiểm tra sự thuần khiết của chủng và đảm bảo chủng không bị chết trước và trong khi tiến hành thử nghiệm. Nếu các chủng đảm bảo mọc tốt và thuần khiết cả trước và sau thử nghiệm thì mới tiếp tục đọc kết quả của chủng chuẩn và chủng thí nghiệm.
Kiểm tra tình trạng mọc của vi khuẩn sau khi ủ qua đêm ở 37độ C. Đọc kết quả của các chủng chuẩn trước, so sánh kết quả MIC của các chủng chuẩn với khoảng nhạy cảm kháng sinh theo tiêu chuẩn của CLSI, nếu những kết quả này nằm trong giới hạn, sai số cho phép là một bậc nhỏ hơn hoặc một bậc lớn hơn, điều đó nói lên rằng các điều kiện của thí nghiệm đã đạt được chuẩn thức: nồng độ kháng sinh, nhiệt độ, dinh dưỡng của môi trường, mật độ của vi khuẩn… Như vậy có thể
tiếp tục đọc kết quả ở những chủng thí nghiệm. Nếu khơng đạt được như trên, bắt buộc phải làm lại thí nghiệm, đồng thời phải kiểm tra lại các điều kiện của thí nghiệm sao cho đúng chuẩn thức.
Đọc kết quả lần lượt từ đĩa thạch có nồng độ kháng sinh thấp nhất đến cao nhất. Nồng độ MIC được xác định ở đĩa mơi trường mà ở đó các vi khuẩn bị ức chế phát triển, mật độ vi khuẩn giảm hẳn ≤3 khuẩn lạc mọc. Ở nồng độ thấp nhất (0,04µg/ml) mà khơng có vi khuẩn mọc thì kết quả MIC được ghi nhận là ≤0,04µg/ml. Trong trường hợp đến nồng độ cao nhất (128µg/ml) mà vẫn thấy vi khuẩn mọc thì kết quả MIC được ghi nhận là >128µg/ml.
Kết quả MIC của các chủng sẽ được so sánh với nồng độ của các khoảng nhạytương ứng với tùng loại kháng sinh (Bảng 2.1) để xác định tính kháng của vi khuẩn đối với loại kháng sinh đó là nhạy cảm, trung gian hay kháng.
2.3.2 Kỹ thuật điện di xung trƣờng (PFGE) 2.3.2.1 Quy trình tiến hành
Các bước tiến hành kỹ thuật PFGE sẽ được thực hiện theo quy trình của Samy Selim và cộng sự [95]. Đầu tiên, các chủng vi khuẩn sẽ được nuôi cấy trên thạch Mueller-Hinton, ủ ở 37độ C qua đêm. Sau đó hịa tan các khuẩn lạc riêng rẽ vào dung dịch đệm (EDTA)–saline buffer (75 mmol/L NaCl and 25 mmol/L EDTA, pH 7,5). Trộn đều huyền phù vi khuẩn với thạch SeaKem Gold (Lonza, Ý) nóng chảy theo tỉ lệ 1:1 và hút cho vào khuôn tạo plug. Các plug sẽ được chuyển sang ống phancol chứa 5ml dung dịch đệm ly giải (6 mmol/L Tris–HCl (pH 7,6), 0,1 mol/L EDTA, 1 mol/L NaCl, 0,5% Brij®58 (polyoxyethylen (20) cetyl ether; Sigma), 0,4% sodium deoxycholate, 0,5% sodium lauryl sarcosine and 1 mg/mL lysozym) và ủ ở 37độ C trong 24 giờ. Sau đó, dung dịch đệm ly giải sẽ được thay thế bởi 5ml dung dịch đệm proteinase K (1% sodium lauryl sarcosine, 0,5 mol/L EDTA (pH 8,0) and proteinase K (50 μg/mL; Sigma)) và ủ và lắc nhẹ ở 50 độ C trong khoảng 20 giờ. Loại bỏ dung dịch đệm proteinase K, các plug sau đó sẽ được rửa 2 lần trong ống phancol chứa 10ml nước khử ion vô trùng, mỗi lần 10-15 phút, ở 50- 55 độ C. Lặp lại bước rửa này 4 lần với dung dịch đệm Tris–EDTA buffer (10
mmol/L Tris–HCl (pH 8,0) and 1 mmol/L EDTA). ADN toàn phần của các chủng P.
aeruginosa chứa trong plug sẽ được cắt bằng enzym giới hạn SpeI (Biolabs New
England), nồng độ 30U/miếng thạch ủ 37độ C trong vòng 18-20 giờ). Các phân đoạn ADN được phân tách bằng hệ thống điện di xung trường trên gel Seakem-Gold 1%, CHEF-DR III (Biorad laboratories, Richmond, CA, Mỹ) với hiệu điện thế 6V/cm trong 20 giờ ở nhiệt độ 14độ C, thời gian một xung từ 2 đến 40 giây và góc điện trường là 120 độ. Sau điện di, gel được nhuộm dung dịch ethidium bromide trong 30 phút, rửa bằng nước cất 2 lần khoảng 30 phút và chụp ảnh bằng máy chụp ảnh gel-doc. ADN toàn phần của chủng vi khuẩn S. braendrup H9812 được cắt bằng enzym XbaI (Biolabs New
England) sẽ được sử dụng làm thang chuẩn để phân tích.
Bảng 2.2: Các hóa chất đƣợc sử dụng trong kỹ thuật PFGE
Tên hóa chất Thành phần Nồng độ
EDTA-saline
buffer EDTA (pH 8,0) NaCl
Nước khử ion
25 mmol/L 75 mmol/L
Lysis Buffer Tris-HCl (pH 7,6)
NaCl EDTA (pH 8,0) Brij58 Sodium deoxycholate Lysozyme sodium laurylsarcosine nước khử ion 6 Mm 1 mol/L 0,1 mol/L 0,5% 0.4% 1mg/mL 0,5% Proteinase K
buffer EDTA (pH 8,0) Proteinase K N-Lauroylsarcosine 0,5 mol/L 50 μg/mL 1% TE EDTA (pH 8,0) Tris-HCl (pH 7,6) Nước khử ion 1 mmol/L 10 mmol/L Restriction buffer SpeI Buffer Nước khử ion 10 U/μL 1X
TBE Boric Acid Tris EDTA (pH 7,6) Nước khử ion 0,5X 2.3.2.2 Phân tích kết quả
Kết quả PFGE sẽ được phân tích trên phần Bionumerics version 6.6. Các băng ADN của vi khuẩn sẽ được so sánh với nhau và so sánh với chủng chuẩn S.
braendrup (H9812) để xây dựng cây phát sinh chủng loại. Các chủng được xem là
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3
3.1 Mức độ nhạy cảm kháng sinh của P. aeruginosa
3.1.1 Sƣ̣ phân bố của P. aeruginosa theo mẫu bệnh phẩm và theo Khoa
Trong số 70 (n=70) chủng P. aeruginosa thu thập đươ ̣c trong giai đoa ̣n
2/2012 đến 7/2014, từ nhiều mẫu bệnh phẩm khác nhau như dịch phế quản, dịch mổ, nước tiểu…thì dịch phế quản chiếm tỷ lệ nhiều nhất là 54% (n=38/70), tiếp đến là dịch mổ với 9% (n=6/70), đờm là 7% (n=5/70), mủ là 7% (n=5/70), nước tiểu là 6% (n=4/70), còn lại là 17% (n=12/70) của các mẫu bệnh phẩm khác (Phụ lục 1). Việt Đức là bệnh viện ngoại khoa hàng đầu nước ta với các ca bệnh nặng, bệnh nhân nằm viện lâu, gặp khó khăn trong q trình hơ hấp nên phải thở bằng máy thở, vì thế dịch phế quản là mô ̣t trong các loại mẫu chính thu được từ đây. Điều này cũng hồn toàn phù hợp với đặc thù của bệnh viện Việt Đức.
Hình 3.1: Tỉ lệ P. aeruginosa phân lập đƣợc trong các mẫu bệnh phẩm
Sự phân bố của P. aeruginosa theo Khoa được thể hiện tại Hình 3.2. Có thể thấy, các chủng P. aeruginosa được phát hiện ở nhiều khoa với tỉ lệ khác nhau:
khoa Hồi sức chiếm tỉ lệ cao nhất 64% (n=45/70), sau đó là khoa Phẫn thuật thần kinh (PTTK) chiếm 9% (n=6/70); khoa Chấn thương chiếm 6% (n=4/70); khoa Gan mật chiếm 4% (n=3/70); khoa Tiết niệu chiếm 3% (n=2/70); cịn lại tỉ lệ nhiễm P.
Hình 3.2: Tỉ lệ phân bố các chủng P. aeruginosa theo Khoa
Sự phân bố của P. aeruginosa tập trung chủ yếu ở khoa Hồi sức có thể giải thích là bệnh nhân sau khi tiến hành các trị liệu khác như phẫu thuật sọ não, phẫu thuật chấn thương, ... thì được đưa về khoa Hồi sức để điều trị và chăm sóc. Lúc đó hệ miễn dịch của bệnh nhân suy giảm là cơ hội cho các vi khuẩn cư trú ở bệnh viện tấn công và gây bệnh. Do vậy có thể nói khoa Hồi sức là nơi có tỉ lệ nhiễm vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện cao, trong đó có P. aeruginosa.
3.1.2 Mức độ nhạy cảm kháng sinh của P. aeruginosa
Hình 3.3 cho thấy hình ảnh của các chủng P. aeruginosa mọc trên đĩa tha ̣ch Mueller- Hinton đối chứng không có kháng sinh (A), có kháng sinh (B). Giá trị MIC của mô ̣t kháng sinh đối với mô ̣t chủng sẽ được tính ta ̣i nồng đô ̣ chủng đó b ắt đầu bi ̣ ức chế sinh trưởng, còn ≤ 3 khuẩn la ̣c.
A: Các chủng P. aeruginosa mọc trên đĩa thạch MH khơng có kháng sinh
B: Các chủng P. aeruginosa mọc trên đĩa thạch MH có kháng sinh
Hình 3.3: Chủng mọc trên đĩa thạch khơng có kháng sinh và có kháng sinh
Phương pháp MIC được thực hiện cho 70 chủng P. aeruginosa. Kết quả MIC cho thấy các chủng P. aeruginosa phân lập tại bệnh viện Việt Đức kháng với phần lớn các kháng sinh được thử nghiệm và cũng là kháng sinh hiện đang được sử dụng rộng rãi để điều tri cho các bệnh nhân nhiễm trùng bệnh viện ở Việt Nam nói chung và Việt Đức nói riêng. Cụ thể là có 5 kháng sinh có tỉ lệ P. aeruginosa kháng cao bao gồm: ceftazidime (85,7%) với 57 chủng kháng hoàn toàn chiếm 81,4%, với MIC cao nhất >256µg/ml và 3 chủng kháng trung gian chiếm 4,3%; aztreonam (81,4%) với 31 chủng kháng hoàn toàn chiếm 44,3% (MIC cao nhất >128µg/ml) và 26 chủng kháng trung gian chiếm 37,1%; imipenem (97,1%) với 68 chủng kháng hồn tồn (MIC cao nhất >128µg/ml) và khơng có chủng nào kháng trung gian; gentamicin (87,1%) với 61 chủng kháng hoàn toàn (MIC cao nhất >128µg/ml) và khơng có chủng nào kháng trung gian; ciprofloxacin (87,2%) với 59 chủng kháng hoàn toàn chiếm 84,3% (MIC cao nhất >128µg/ml) và 2 chủng kháng trung gian chiếm 2,9%. Chỉ có một tỉ lệ thấp kháng với amikacin (27,1%) với 18 chủng kháng hoàn toàn (25,7%) và 1 chủng kháng trung gian chiếm 1,4% (Bảng 3.1), chứng tỏ
hiện sự đa kháng thuốc của P. aeruginosa và mức độ kháng là khá cao. Khả năng kháng mạnh mẽ này chính là hê ̣ quả của áp lực chọn lọc do việc sử dụng kháng sinh trong điều trị.
Bảng 3.1: Mức độ nhạy cảm kháng sinh của P. aeruginosa đối với các loại
kháng sinh
Kháng sinh Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC µg/ml) (n=70)
Kháng hoàn toàn Kháng trung gian Nhạy Ceftazidime 57 (81,4%) (32 - >256 µg/ml) 3 (4,3%) (16 µg/ml) 10 (14,3%) (4-8 µg/ml) Aztreonam 31 (44,3%) (32- >128 µg/ml) 26 (37,1%) (16 µg/ml) 13 (18,6%) (1-8 µg/ml) Imipenem 68 (97,1%) (8->128 µg/ml) 0% 2 (2,9%) (1-2 µg/ml) Amikacin 18 (25,7%) (64->256 µg/ml) 1 (1,4%) (32 µg/ml) 51 (72,9%) (2-16 µg/ml) Gentamycin 61 (87,1%) (16->128µg/ml) 0% 9 (12,9%) (1-4 µg/ml) Ciprofloxacin 59 (84,3%) (4->128 µg/ml) 2 (2,9%) (2 µg/ml) 9 (12,8%) (0,125-1 µg/ml) Mặc dù đều có tỉ lệ kháng cao, nhưng tỉ lệ kháng hoàn toàn và kháng trung gian của P. aeruginosa là khác nhau đối với từng loại kháng sinh. Các kháng s inh như ceftazidime, amikacin và ciprofloxacin có sự chênh lệch rất lớn giữa tỉ lê ̣ kháng và kháng trung gian, tương ứng là 81,4% với 4,3%; 25,7% với 1,4% và 84,3% với 2,9%. Đối với các kháng sinh imipenem và gentamycin thì tỉ lệ kháng trung gian chiếm 0%, do vâ ̣y tỉ lê ̣ kháng thu được đều thuô ̣c nhóm kháng hoàn toàn , tương ứng
trung gian tăng lên rất cao, dẫn đến sự chênh lê ̣ch với tỉ lệ kháng hồn tồn khơng có nhiều khác biệt , tương ứng là 44,3% với 37,1% (Hình 3.4). Như vậy có thể thấy,
P. aeruginosa có xu hướng kháng hồn tồn đới với hầu hết các kháng sinh với các giá trị MIC cao.
Hình 3.4: Tỉ lệ P. aeruginosa kháng hồn tồn và kháng trung gian với các loại kháng sinh
Kết quả của chúng tôi khi so sánh với các nghiên cứu trước của một số tác giả trong nước cho thấy:
Mức độ kháng ceftazidime (kháng sinh đại diện cho nhóm cephems) của các chủng P. aeruginosa trong nghiên cứu của chúng tôi là cao hơn hẳn so với các nghiên cứu đã được báo cáo trước đó. Theo nghiên cứu của Nguyễn Phú Hương Lan và cộng sự năm 2010, tỉ lệ kháng ceftazidime là 31% [8], năm 2017 theo Trần Văn Ngọc và cộng sự tỉ lệ kháng ceftazidime là 46% [10], trong khi của chúng tôi là 85,7%.
Tỉ lệ kháng aztreonam (kháng sinh đại diện cho nhóm monobactam) của các chủng P. aeruginosa trong nghiên cứu của chúng tôi là 81,4%, cao hơn so với nghiên cứu của Hồng Dỗn Cảnh năm 2014 (42,9%) [1] và Vũ Ngọc Hiếu năm
Tỉ lệ P. aeruginosa kháng với kháng sinh amikacin (đại diện cho nhóm aminoglycoside) trong nghiên cứu của chúng tơi là 27,1%, có sự tương đồng với nghiên cứu của Bùi Khắc Hậu năm 2008 và Nguyễn Phú Hương Lan năm 2010 với tỉ lệ kháng lần lượt là 29,1 [3], 25,3% [8].
Có sự gia tăng một cách rõ rệt trong tỉ lệ kháng của P. aeruginosa đối với
kháng sinh imipenem (đại diện cho nhóm carbapenem), gentamicin (đại diện cho nhóm aminoglycoside) và ciprofloxacin (đại diện cho nhóm fluroquinolones). Theo nghiên cứu của tác giả Bùi Khắc Hậu năm 2008, tỉ lệ P. aeruginosa kháng imipenem, gentamicin và ciprofloxacin tương ứng là 15,8%; 54%; 30,9% [3]; theo Hồng Dỗn Cảnh (2014) tỉ lệ kháng các kháng sinh lần lượt là 46,2%, 55,6%, 48,2% [1]; của chúng tôi tương ứng là 97,1%; 87,1%; 87,2%. Sự gia tăng này là một sự báo động về mức độ vi khuẩn kháng kháng sinh, đờng thời về tình trạng sử dụng kháng sinh không rô ̣ng rãi ở Việt Đức nói riêng và ở Việt Nam nói chung.
Kết quả thử nghiệm MIC của các chủng P. aeruginosa trong nghiên cứu của chúng tôi khi so sánh với các nghiên cứu trên thế giới cũng thể hiện sự khác biệt một cách rõ rệt. Theo Zeynab Golshani và cộng sựu năm 2012, tỉ lệ kháng hoàn toàn với ciprofloxacin, gentamicin, imipenem lần lượt là 58%, 60%, 58%, thấp hơn so với của chúng tôi, tương ứng là 84,3%; 87,1%; 97,1%. Tương tự theo như Sheetal Sharma và cộng sự tỉ lệ kháng amikacin, ciprofloxacin, imipenem thấp hơn rất nhiều so với nghiên cứu của chúng tôi với tỉ lệ kháng hoàn toàn lần lượt là 18,25%; 31,74%; 0% [98]. Điều đó chỉ ra rằng mức độ kháng thuốc của các chủng
P. aeruginosa trong nghiên cứu là rất cao. Sự khác nhau trong tỉ lệ kháng kháng sinh ở các địa điểm nghiên cứu khác nhau, cho thấy mức độ và cơ chế đề kháng của vi khuẩn phụ thuộc nhiều vào điều kiện môi trường như áp lực chọn lọc tự nhiên do sử dụng kháng sinh cũng như hiệu quả của cơng tác kiểm sốt nhiễm khuẩn bệnh viện.
Qua các kết quả đánh giá về mức độ nhạy cảm kháng sinh của các chủng P.
aeruginosa phân lập tại Việt Đức và đối chiếu với các kết quả nghiên cứu trong
nước và ngoài nước đã thể hiện rằng có sự gia tăng một cách mạnh mẽ về tỉ lệ kháng kháng sinh của P. aeruginosa. Tuy nhiên nghiên cứu cũng cho thấy vẫn còn
một tỉ lệ lớn các chủng P. aeruginosa vẫn còn nhạy cảm với kháng sinh amikacin
(72,9%), do đó có thể khuyến cáo rằng khi điều trị cho bệnh nhân bị nhiễm trùng không nhất thiết phải sử dụng ln các kháng sinh có phổ tác dụng mạnh, giá thành đắt để tránh tạo áp lực cho vi khuẩn kháng lại kháng sinh mà có thể lựa chọn các kháng sinh cịn nhạy cảm với mức chi phí thấp hơn và phù hợp hơn.
3.2. Kiểu gen của các chủng P. aeruginosa phân lập tại bệnh viện Việt Đức
ADN của 70 chủng P. aeruginosa được cắt bằng enzym SpeI sau đó chạy
điện di xung trường trong 20 giờ. Kết quả được đọc bằng máy Biodoc và được phân tích bằng phần mềm BioNumerics version 6.6.
Hình 3.5: Hình ảnh đại diện cho kiểu gen của các số chủng P. aeruginosa phân lập tại bệnh viện Việt Đức
Giếng số 1: 1256/HS/2013; 2: 1257/TM/2013; 3: 1258/HS/2013; 4: 1272/HS/2014; 5: 1274/HS/2013; 6: 1415/HS/2013; 7: 1556/HS/2014; 8: 1557/HS/2014; 9: 1558/HS/2014; 10: 1578/PTSN/2014; 11: 1586/ HS/2014; 12: 1581/CT/2014. M:
Hình 3.6: Cây phân nhóm kiểu gen của các chủng P. aeruginosa phân lập tại bệnh viện Việt Đức
Chú giải: HS, HSSM: hồi sức; PTTK: phẫu thuật thần kinh; TLM: thận lọc máu; GM: gan mật;
PTGM: phẫu thuật gan mật; PTCCB: phẫu thuật cấp cứu bụng; TN: tiết niệu; TM: tim mạch; CT: chấn thương; ĐTTN: điều trị tự nguyện
Thu thập mẫu bệnh phẩm (Bệnh viện Việt Đức)
Xác định nồng độ tối thiểu ức chế vi khuẩn (MIC) (VVSDTTƯ)
Nuôi cấy và định danh vi khuẩn
(Bệnh viện Việt Đức)
Phân tích mối liên hệ kiểu gen giữa các chủng P. aeruginosa(PFGE) (VVSDTTƯ) Dương tính với P. aeruginosa (Bệnh viện Việt Đức)
Phân tích kết quả PFGE cho thấy có thể chia thành 11 nhóm kiểu gen với độ tương đồng ≥ 80%, được kí hiệu từ I đến XI (hình 3.6).
Nhóm I: gồm 2 chủng phân lập từ nước tiểu và dịch phế quản ở khoa Tiết
niệu và Hồi sức vào năm 2013.
Nhóm II: là nhóm có sự phân bố các chủng lớn nhất với 21 chủng chủ yếu
phân lập từ dịch phế quản ở khoa Hồi sức trong cả 3 năm từ 2012 đến 2014. Đáng chú ý là các cặp 734 và 741; 1672 và 1674 có kiểu gen tương đồng 100% và được phân lập từ cùng 1 khoa.
Nhóm III: có 4 chủng được phân lập từ đờm và dịch phế quản ở khoa Hồi
sức vào năm 2012.
Nhóm IV: có 3 chủng được phân lập từ mẫu dịch phế quản và cùng khoa
Hồi sức trong năm 2012.
Nhóm V: có 2 chủng phân lập từ đờm và dịch phế quản ở khoa Hồi sức
trong 2 năm 2012 và 2014.
Nhóm VI: có 2 chủng được phân lập từ máu và đờm ở khoa Chấn thương và
Hồi sức trong năm 2012.
Nhóm VII: có 3 chủng được phân lập từ dịch phế quản và đờm ở cùng khoa
Hồi sức vào năm 2012.
Nhóm VIII: có 2 chủng được phân lập từ cùng một loại mẫu là dịch phế
quản ở khoa Hồi sức trong năm 2012.
Nhóm IX: gồm 3 chủng được phân lập từ dịch phế quản và đờm ở khoa Hồi
sức vào năm 2012, trong đó có chủng 802 và 803 có độ tương đồng 100%.
Nhóm X: gồm 5 chủng được phân lập từ các mẫu dịch nhiễm trùng, mủ và