Khối I: khối này gồm các thiết bị dùng để tách các cấu tử trong hỗn hợp cần phân tích ra khỏi nhau, gồm hệ sắc ký và các bộ phận vận hành sắc ký.
Hệ sắc ký gồm: 1- Cột sắc ký
2- Bom chứa pha động (khí mang) Các bộ phận vận hành sắc ký:
3- Bộ phận điều chỉnh tốc độ pha động 4- Bộ phận bơm mẫu và buồng bơm mẫu 5- Bộ phận điều nhiệt
Khối II: bao gồm các thiết bị và bộ phận nhận biết cấu tử ra khỏi cột và nhận biết kết quả. Trong đó:
D: Detectơ (bộ phận nhận biết chất), là một máy phân tích hồn chỉnh, cho biết từng chất hoặc nhóm chất ra khỏi cột với tín hiệu tỉ lệ với hàm lượng tương
ứng.
6- Bộ phận phân tích sắc đồ 7- Bộ phận ghi sắc đồ
c. Nguyên tắc vận hành của sắc ký khí
Bộ phận quan trọng nhất của máy phân tích sắc ký là hệ thống cột tách và detectơ. Nhờ có khí mang chứa trong bom mà mẫu từ buồng bay hơi được dẫn vào cột tách nằm trong buồng điều nhiệt. Quá trình sắc ký diễn ra tại đây, sau khi các
cấu tử rời bỏ cột tại các thời điểm khác nhau, các cấu tử lần lượt đi vào detectơ, tại
khuếch đại rồi chuyển sang bộ phận ghi hoặc chuyển sang phân tích kế có máy tính, tín hiệu được xử lý ở đó và chuyển sang bộ phận ghi kết quả. Trên sắc đồ nhận được từ bộ phận ghi, ta có các tín hiệu ứng với các cấu tử cần tách ra gọi là píc [7].
Thời gian lưu là đại lượng đặc trưng cho các cấu tử cần tách, được dùng để định tính, cịn diện tích píc là thước đo định lượng cho từng cấu tử trong hỗn hợp
nghiên cứu. Trong sắc ký khí, người ta cần dạng píc khơng bị biến dạng nhiều nhằm xác định chính xác đỉnh píc, đối với phân tích định lượng, yêu cầu đặt ra cao hơn:
độ lặp lại, độ so sánh tốt, độ chính xác cao [7].
Hiện nay, phương pháp phân tích sắc ký khí được sử dụng rộng rãi bởi vì khả năng tách cao và tính sẵn có của detectơ chọn lọc như detectơ cộng kết điện tử
(ECD), detectơ dẫn nhiệt (TCD), detectơ ion hóa ngọn lửa (FID), detectơ nitơ phốt pho (NPD), và detectơ ghép khối phổ (MSD) [12]. Để xác định các thuốc BVTV cơ clo, phương pháp phân tích phù hợp nhất và được lựa chọn trong nghiên cứu này là phương pháp sắc ký khí detectơ cộng kết điện tử.
Detectơ cộng kết điện tử (ECD) hoạt động dựa trên đặc tính các chất có khả năng cộng kết điện tử trong pha khí. ECD là một dạng của detectơ ion hoá, các ion
được tạo ra bởi một nguồn phóng xạ như 3H hoặc 63Ni, chúng phá ra các hạt β, các
hạt này ion hoá các chất (chẳng hạn như khí mang N2 + β → N2+ + 2 e) và tạo ra một dòng điện nền. Khi các chất có khả năng bắt điện tử đi qua, chúng sẽ bắt giữ điện tử làm giảm đường nền và gây ra các tín hiệu tương ứng. ECD rất chọn lọc với
các nguyên tố có độ âm điện cao như halogen, sulfua và những chất có cấu trúc chưa no [17].
d. Định tính và định lượng
- Định tính: trên sắc đồ nhận được sẽ có các tín hiệu ứng với các cấu tử được
tách gọi là píc. Người ta sử dụng yếu tố đặc trưng là thời gian lưu của các cấu tử để nhận diện chúng, bằng cách so sánh thời gian lưu của cấu tử cần xác định với thời gian lưu của chất chuẩn. Việc nhận diện một cấu tử chính xác hay không phụ thuộc vào sự giống nhau của mẫu phân tích so với mẫu chuẩn và chỉ được khẳng định khi thời gian lưu của chất cần phân tích trùng với giá trị thời gian lưu của chất chuẩn.
Trong nghiên cứu này, thời gian lưu của từng cấu tử trong chất chuẩn được xác định dựa vào tín hiệu ghi nhận bởi detectơ ECD.
- Định lượng: diện tích píc là thước đo định lượng các chất trong hỗn hợp
nghiên cứu. Dựa vào mối tương quan giữa số đếm diện tích píc và nồng độ chất
chuẩn sẽ dựng được đường ngoại chuẩn thể hiện mối tương quan này. Từ số đếm
diện tích píc thu được của các mẫu phân tích và đường ngoại chuẩn sẽ xác định
được nồng độ chất cần nghiên cứu trong mẫu.
2.2.3.5. Tiến hành thực nghiệm a. Hóa chất
- Dung môi: Diclometan, n-Hexan, Etyl axetat, Metanol,… loại tinh khiết dùng cho sắc ký của các hãng Merck (Đức).
- H2SO4 98%, C2O3.
- Pha rắn C18, đường kính hạt khoảng 0,5 μm và đường kính lỗ rỗng 60 Å (Tomelloso, Tây Ban Nha), cột chiết pha rắn có dung tích 500 mg.
- Khí N2 có độ tinh khiết 99,9% và 99,999%.
- Nhơm oxit (Al2O3) trung tính pH = 6,5-7,5 có kích thước hạt 320 - 630 mesh của hãng Merck (Đức), diện tích bề mặt 155 m2/g, Al2O3 được sấy khơ và hoạt hố ở nhiệt độ 130oC trong 5 giờ.
- Các chất chuẩn và nồng độ của từng chất chuẩn: α-BHC (1,05 ppm); β-
BHC (1,03 ppm); γ-BHC (1,033 ppm); δ-BHC (0,97 ppm); Hexachlorbenzen (1,053 ppm); Heptachlor (0,505 ppm); α-Chlordene (1,005 ppm); β-Chlordene (1,005 ppm); Oxychlordane (1,055 ppm); trans-Chlordane (1,025 ppm); cis-Chlordane (1,005 ppm); trans-Nonachlor (1,000 ppm); cis-Nonachlor (1,015 ppm); o,p’-DDE (1,038 ppm); p,p’-DDE (1,02 ppm); o,p’-DDD (1,033 ppm), p,p’-DDD (1,053 ppm); o,p’-DDT (1,04 ppm); p,p’-DDT (1,063 ppm). Các chất chuẩn được cung cấp từ Nhật Bản.
b. Thiết bị và dụng cụ
• Dụng cụ:
- Cốc thủy tinh thể tích 10 mL, 30 mL. - Các loại pipet 1 mL, 5 mL, 10 mL. - Ống nghiệm 10 mL.
- Lọ thủy tinh dung tích 30 mL có nút silicon.
- Cột sắc ký bằng thủy tinh có kích thước dài 30 cm, đường kính trong 0,6 cm có gắn van điều chỉnh tốc độ dịng.
Tất cả các dụng cụ thủy tinh sử dụng trong các thí nghiệm đều được làm sạch bằng cách ngâm trong dung dịch rửa (H2SO4 đặc + Cr2O3) khoảng 24h. Sau đó tráng lại bằng nước cất hai lần và axeton, n-Hexan. Dụng cụ đã rửa được sấy ở nhiệt độ
2000C trong 2 giờ. Trước khi sử dụng được tráng 2 lần bằng n-Hexan.
• Thiết bị:
- Tủ sấy 300oC.
- Cân phân tích có độ chính xác ± 0,001 mg. - Máy cơ cất quay chân không.
- Máy hút chân không. - Thiết bị chiết pha rắn.
- Syranh bơm mẫu Hamilton các loại: 10 µL; 100 µL; 500 µL.
- Máy sắc ký khí HP 5890 của Mỹ với detectơ cộng kết điện tử (ECD), cột
sắc ký mao quản HP5_MS dài 60 m, đường kính trong 0,25 mm, lớp phin pha tĩnh dầy 0,25 µm.
Điều kiện làm việc của máy sắc ký khí:
Trên cơ sở tham khảo tài liệu, q trình thực nghiệm và điều kiện hiện có của phịng thí nghiệm, chúng tơi lựa chọn chế độ phân tích dư lượng thuốc BVTV nhóm clo hữu cơ trên máy GC/ECD như sau:
+ Nhiệt độ ban đầu là 900C giữ trong 1 phút; tăng đến 2500C với tốc
độ gia nhiệt là 150C/phút, giữ trong 10 phút; tăng đến 2700C với tốc độ gia
nhiệt 80C/phút, giữ trong 2 phút.
+ Tổng thời gian chạy máy là 33,8 phút. - Nhiệt độ injectơ: 2700C
- Nhiệt độ detectơ: 2600C - Khí mang Nitơ: 99,999% - Áp suất đầu cột: 20 psi
- Bơm: Splitless, đóng van 0,3 phút - Bơm mẫu 1 µL
- Cột sắc ký mao quản HP5 MS dài 60 m, đường kính trong 0,25 mm, lớp phin pha tĩnh dầy 0,25 µm.
c. Xây dựng đường ngoại chuẩn
Đường ngoại chuẩn được sử dụng để xác định nồng độ thuốc BVTV trong
các mẫu mật ong. Trong phương pháp này dùng chất chuẩn tinh khiết của chất cần xác định pha thành nhiều nồng độ khác nhau, dựng đường chuẩn theo số đếm diện tích píc trên sắc ký đồ và nồng độ chất chuẩn phân tích. Dựa vào đường ngoại
chuẩn và số đếm diện tích píc của chất cần phân tích có thể xác định được nồng độ chất cần phân tích.
• Chuẩn bị dung dịch hỗn hợp chất chuẩn:
- Dùng syranh Hamilton lấy chính xác 100µL hỗn hợp chất chuẩn gồm 19 chất
đã biết nồng độ của từng chất (gọi là C0): α-BHC; β-BHC; γ-BHC; δ-BHC;
Hexachlorbenzen (HCB); Heptachlor; α-Chlordene; β-Chlordene;
Oxychlordane; trans-Chlordane; cis-Chlordane; trans-Nonachlor; cis- Nonachlor; o,p’-DDE; p,p’-DDE; o,p’-DDD, p,p’-DDD; o,p’-DDT; p,p’- DDT pha loãng thành 1 mL bằng n-Hexan nhận được dung dịch C1.
- Lấy chính xác 500 µL dung dịch C1 pha loãng thành 1 mL bằng n-Hexan
- Lấy chính xác 500 µL dung dịch C2 pha lỗng thành 1 mL n-Hexan được dung dịch C3.
- Cứ tiếp tục làm như trên cho đến khi được dung dịch hỗn hợp chất chuẩn C4, C5, C6, C7. Nồng độ mỗi chất trong dung dịch hỗn hợp chất chuẩn được thể hiện trong bảng 2.1 dưới đây:
Bảng 2.1. Nồng độ các dung dịch hỗn hợp chất chuẩn Nồng độ chất chuẩn (ppm) Nồng độ chất chuẩn (ppm) Chất chuẩn C0 C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 α-BHC 1,05000 0,10500 0,05250 0,02625 0,01313 0,00656 0,00328 0,00164 HCB 1,05300 0,10530 0,05270 0,02633 0,01316 0,00658 0,00329 0,00165 β-BHC 1,03000 0,10330 0,05170 0,02583 0,01291 0,00646 0,00323 0,00161 γ-BHC 1,03300 0,10330 0,05170 0,02583 0,01291 0,00646 0,00323 0,00161 δ-BHC 0,97000 0,09700 0,04850 0,02425 0,01213 0,00606 0,00303 0,00152 Heptachlor 0,50500 0,05050 0,02520 0,01263 0,00631 0,00316 0,00158 0,00079 α-Chlordene 1,00500 0,10050 0,05030 0,02513 0,01256 0,00628 0,00314 0,00157 β-Chlordene 1,00500 0,10050 0,05030 0,02513 0,01256 0,00628 0,00314 0,00157 Oxychlordane 1,05500 0,10550 0,05280 0,02638 0,01319 0,00659 0,0033 0,00165 trans- Chlordane 1,02500 0,10250 0,05130 0,02563 0,01281 0,00641 0,0032 0,0016 o,p’-DDE 1,03800 0,10380 0,05190 0,02595 0,01298 0,00649 0,00324 0,00162 cis-Chlordane 1,00500 0,10050 0,05030 0,02513 0,01256 0,00628 0,00314 0,00157 trans- Nonachlor 1,00000 0,10000 0,05000 0,02500 0,0125 0,00625 0,00313 0,00156 p,p’-DDE 1,02000 0,10200 0,05100 0,02550 0,01275 0,00638 0,00319 0,00159 o,p’-DDD 1,03300 0,10330 0,05170 0,02583 0,01291 0,00646 0,00323 0,00161 cis-Nonachlor 1,01500 0,10150 0,05080 0,02538 0,01269 0,00634 0,00317 0,00159 o,p’-DDT + p,p’-DDD 2,09300 0,20930 0,10470 0,05233 0,02616 0,01308 0,00654 0,00327 p,p’-DDT 1,06300 0,10630 0,05320 0,02658 0,01329 0,00664 0,00332 0,00166
• Xây dựng đường ngoại chuẩn:
Lấy các dung dịch hỗn hợp chuẩn C3, C4, C5, C6, C7 đã pha ở trên, tiến hành phân tích các dung dịch này trên máy GC/ECD với điều kiện làm việc của
bơm mẫu là 1 µL và ở cùng điều kiện sắc ký khí. Ở mỗi mức nồng độ nhận được
một giá trị số đếm diện tích píc là giá trị trung bình của kết quả 3 lần phân tích. Từ các giá trị nồng độ và số đếm diện tích píc thu được xây dựng đường ngoại chuẩn
riêng cho từng chất.
d. Nghiên cứu lựa chọn thể tích dung mơi rửa giải và điều kiện làm sạch mẫu
• Khảo sát thể tích dung mơi rửa giải
Luận văn sử dụng phương pháp chiết pha rắn với cột chiết C18 để tách chiết các chất nghiên cứu ra khỏi mẫu mật ong. Mẫu cho qua cột C18, khi đó các chất nghiên cứu được giữ lại trên cột và tiếp theo được rửa giải bằng dung mơi thích
hợp. Có nhiều loại dung mơi khác nhau được lựa chọn để rửa giải. Dung môi được lựa chọn cần phải hịa tan tốt các chất cần phân tích bị hấp phụ trên cột chiết nhằm
đạt được hiệu suất thu hồi cao. Trên cơ sở tài liệu tham khảo và thực tiễn nghiên
cứu sử dụng dung môi n-Hexan, điclometan, hỗn hợp điclometan và n-Hexan, etyl axetat, hỗn hợp nước và metanol để tách chất, luận văn đã chọn sử dụng dung môi rửa giải là etyl axetat. Etyl axetat cho hiệu suất tách chất tốt nhất và cao nhất.
Thể tích dung mơi sử dụng cho bước rửa giải cũng là một yếu tố rất quan trọng, nó quyết định đến độ sạch và hiệu suất tách chất. Nếu thể tích rửa giải quá ít sẽ không rửa giải hết chất cần nghiên cứu ra khỏi cột, mặt khác nếu thể tích này q nhiều có thể dẫn đến dịch sau chiết lẫn các tạp chất khơng mong muốn đồng thời gây lãng phí dung mơi.
Trên cơ sở sử dụng hỗn hợp chất chuẩn và mẫu mật ong cho thêm chất chuẩn, chúng tơi tiến hành khảo sát thể tích dung mơi rửa giải etyl axetat ở 3 mức 5 mL, 10 mL và 15 mL. Kết quả nghiên cứu nêu ở chương 3.
• Khảo sát khả năng loại bỏ tạp chất trong dịch chiết của cột sắc ký
Dịch tách chất thu được từ cột chiết pha rắn C18 còn chứa nhiều tạp chất làm
ảnh hưởng đến kết quả phân tích. Vì vậy, dịch tách chất này cần được làm sạch trên
cột sắc ký chứa chất hấp phụ phù hợp, nghiên cứu này sử dụng chất hấp phụ là nhơm oxit. Trong q trình nghiên cứu đã tiến hành khảo sát khả năng làm sạch của cột sắc ký chứa Al2O3 đối với các chất cần xác định trong mẫu tự tạo là hỗn hợp
chất chuẩn và dịch tách chất chuẩn trên cột C18 của mẫu mật ong có cho thêm chất chuẩn trước khi áp dụng tách các chất trong các mẫu thực tế.
Cột sắc ký nhôm oxit Al2O3 được tạo thành từ cột sắc ký thủy tinh có kích
thước dài 30 cm, đường kính trong 0,6 cm được nhồi các chất theo thứ tự từ dưới lên: bông thủy tinh, 2 g nhơm oxit Al2O3, cột được hoạt hóa bằng 10 mL n-Hexan trước khi sử dụng. Kết quả nghiên cứu nêu ở chương 3.
e. Xác định khả năng thu hồi mẫu
Nghiên cứu khả năng thu hồi mẫu bằng cách sử dụng một mẫu mật ong để nghiên cứu. Lấy 2 lượng mẫu (M1 và M2) từ mẫu mật ong đã lựa chọn, mỗi lượng mẫu lấy 1 g. Mẫu M1 cho 1 mL dung dịch chuẩn C5, mẫu M2 giữ nguyên (mẫu trắng). Sau đó, thực hiện hòa tan 2 mẫu M1, M2 trong 5 mL nước cất; và tách chất trên cột chiết pha rắn C18, cột sắc ký Al2O3 và phân tích chất trên GC/ECD ở điều kiện đã lựa chọn.
Độ thu hồi chất (R) được tính theo cơng thức:
2 1 0 (%) m m 100 R m − = × Trong đó:
m1: Số đếm diện tích píc của các chất trong mẫu trắng m2: Số đếm diện tích píc của các chất trong mẫu tự tạo m0: Số đếm diện tích píc của các chất trong mẫu chuẩn
f. Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
Giới hạn phát hiện là nồng độ mà tại đó giá trị xác định được lớn hơn độ
không đảm bảo đo của phương pháp. Đây là nồng độ thấp nhất của chất phân tích
trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được [6].
Giới hạn định lượng là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà
ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát [6].
Để xác định LOD, LOQ của phương pháp phân tích GC/ECD, nghiên cứu
xây dựng được ở phần c mục 2.2.3.5. Khi đó, LOD và LOQ được xác định bằng công thức sau: 3 LOD s δ = 10 LOQ s δ = Trong đó: δ : độ lệch chuẩn
s: là độ dốc của đường chuẩn
Độ lệch chuẩn được xác định dựa trên độ lệch của khoảng cách các giá trị đo
thực với đường ngoại chuẩn:
( )2 2 i Y Y n δ = − − ∑ Trong đó:
Y: là số đếm diện tích pic của hỗn hợp dung dịch chuẩn;
Yi là giá trị thực tính được từ phương trình đường ngoại chuẩn ứng với mỗi giá trị nồng độ X;
Chương 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Đường ngoại chuẩn của các thuốc BVTV cơ clo nghiên cứu
3.1.1. Nhận diện chất phân tích trên sắc ký đồ của chất chuẩn
Sắc đồ của các chất chuẩn được chỉ ra ở hình 3.1.