Dung môi Khối lƣợng cao dịch chiết (…g/5g bột)
n- Hexan 0,0536
Ethyl acetate 0,0292
Methanol 1,2864
Chúng tôi chọn ba loại dung mơi n-hexan, ethyl acetate, methanol có độ phân cực tăng dần, tương ứng là 0,0; 4,4; 5,1 [56] để tách chiết bột hà thủ ơ đỏ. Chính vì thế mà chúng có thể hịa tan được rất nhiều các nhóm chất khác nhau có trong hà thủ ơ. n-Hexane là dung môi không phân cực, sẽ chiết rút được các hợp chất không phân cực, chẳng hạn như các loại dầu. Ethyl acetate có độ phân cực là 4,4, do đó nó có khả năng hịa tan các chất có độ phân cực khá lớn, ví dụ như các keton. Methanol có độ phân cực cao nhất, vì vậy mà có thể hịa tan các chất có tính phân cực cao như các chất có chứa nhóm –OH hay –NH2.
Từ bảng kết quả trên, ta thấy rằng lượng cao dịch chiết thu được khi tách chiết 5 g bột hà thủ ô đỏ bằng dung môi methanol là cao nhất, cao gấp 44 lần so với tách bằng ethyl acetate và 24 lần so với tách bằng n-hexan. Điều này chứng tỏ rằng, rễ hà thủ ô đỏ chứa một hàm lượng khá lớn các hợp chất có tính phân cực.
3.2. Kết quả nghiên cứu in vitro.
3.2.1. Kết quả hoạt hóa và nhân ni tế bào.
Tế bào melanoma SK-MEL-28 được hoạt hóa và nhân ni trong mơi trường DMEM chứa 10% FBS và 1% streptomycin, ở điều kiện 37˚C, 5% CO2. Sau khi
nuôi cấy, chúng tôi tiến hành cấy chuyển, nhân nuôi tế bào số lượng lớn nhằm mục đích phục vụ cho các thí nghiệm sau. Hình 3.1 là ảnh chụp tế bào SK-MEL-28 chụp ở vật kính 10, độ phóng đại 5,6X sau 24 giờ hoạt hóa.
Hình 3.1. Tế bào SKMEL-28 (sau 24h hoạt hóa).
Hình ảnh cho thấy, chúng tơi đã thành cơng trong việc hoạt hóa và nhân ni dịng tế bào SK-MEL-28 chuẩn bị cho các thí nghiệm sau.
3.2.2. Độc tính của cao dịch chiết hà thủ ơ đỏ đối với sự sinh trưởng của tế bào SK-MEL-28. SK-MEL-28.
Những chất có mang hoạt tính sinh học thường là những hợp chất phân cực mạnh, do vậy chúng tôi sử dụng dịch chiết hà thủ ô đỏ trong methanol để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.
Đầu tiên, chúng tôi tiến hành khảo sát độc tính của cao dịch chiết HTO đỏ `trong methanol đối với sự sinh trưởng của tế bào như sau:
Chúng tôi tiến hành nuôi cấy tế bào SK-MEL-28 trong đĩa 6 giếng. Sau 24 giờ, tế bào ổn định, bám dính ở bề mặt đĩa ni cấy, chúng tôi tiến hành tra các cao dịch chiết đã pha trong DMSO (nồng độ DMSO nhỏ hơn 0,05% để không ảnh hưởng đến tế bào) với các nồng độ từ C1 đến C5 trong các giếng tương ứng là 312,5µg/ml; 625µg/ml; 1250µg/ml; 2500µg/ml; 5000µg/ml và sử dụng một giếng làm đối chứng (NC), giếng đối chứng được nuôi cấy với mơi trường có 0,05% DMSO.
Sau khi tra thuốc 24h, tiến hành nhuộm tím tinh thể, chúng tơi thu được hình ảnh (hình 3.2).
Hình 3.2. Tế bào sau khi bổ sung cao dịch chiết HTO ở các nồng độ khác nhau.
Chú thích: NC: Tế bào ni cấy trong mơi trường có bổ sung 0,05% DMSO. C1: HTO nồng độ 312,5µg/ml. C2: HTO nồng độ 625µg/ml. C3: HTO nồng độ 1250µg/ml. C4: HTO nồng độ 2500µg/ml. C5: HTO nồng độ 5000µg/ml.
Sau khi chụp ảnh tế bào (hình 3.2), chúng tơi tiến hành hịa tan tế bào trong dung dịch SDS 10% và đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 530 nm. Từ kết quả đo OD, chúng tôi tiến hành xây dựng biểu đồ 1 nhằm đánh giá độc tính của cao dịch chiết HTO đối với tế bào.
Chú thích: NC: Tế bào ni cấy ở mơi trường có bổ sung 0,05% DMSO. C1: HTO nồng độ 312,5µg/ml. C2: HTO nồng độ 625µg/ml. C3: HTO nồng độ 1250µg/ml. C4: HTO nồng độ 2500µg/ml. C5: HTO nồng độ 5000µg/ml.
Dựa vào kết quả thu được từ biểu đồ hình 3.3, chúng tôi nhận thấy ở các nồng độ 312,5 µg/ml, 625 µg/ml, và 1250 µg/ml cao dịch chiết HTO đỏ không gây độc tế bào. Tuy nhiên, ở các nồng độ 2500 µg/ml và 5000 µg/ml, dịch chiết HTO đỏ gây chết 16.2% và 21.6% số lượng tế bào so với đối chứng, một cách tương ứng.
Kết luận:
Cao dịch chiết HTO ở nồng độ nhỏ hơn 5000 µg/ml có độc tính thấp, an tồn với tế bào.
Khi xác định được nồng độ cao dịch chiết ảnh hưởng đến tế bào trong dải nồng độ trên, chúng tôi không tiếp tục thử ở các nồng độ cao hơn và tiến hành xác định ảnh hưởng của cao dịch chiết lên sự tăng sinh tổng hợp melanin của dòng tế bào này ở các nồng độ nhỏ hơn 5000 µg/ml.
3.2.3. Ảnh hưởng của cao dịch chiết lên sự tăng sinh tổng hợp melanin của các tế bào SK-MEL-28. tế bào SK-MEL-28.
Tiếp theo chúng tôi khảo sát khả khả năng kích thích tăng sinh tổng hợp melanin của dịch chiết HTO trên tế bào. Tế bào (105 tế bào) được bổ sung vào các giếng của đĩa 6 giếng và ni trong điều kiện mơi trường bình thường (10% FBS) trong 24 giờ, sau đó tiến hành thay mơi trường bình thường (10% FBS) bằng môi trường nghèo dinh dưỡng (0.5% FBS) và tiếp tục nuôi trong 8 giờ trước khi một lần nữa thay bằng mơi trường bình thường (10% FBS) có bổ sung cao dịch chiết ở các nồng C1 (312,5 µg/ml), C2 (625 µg/ml), và C4 (2500 µg/ml) (giếng đối chứng âm không bổ sung cao dịch chiết) và tiếp tục ni cấy trong 48 giờ. Sau đó đĩa tế bào được mang đi chụp ảnh dưới kính hiển vi để xem sự xuất hiện của melanin nội vào ngoại bào (hình 3.4.).
Hình 3.4. Tế bào sản sinh melanin nội bào và ngoại bào
Chú thích: NC: tế bào đối chứng, không bổ sung cao dịch chiết HTO đỏ. HTO: tế bào nuôi cấy được bổ sung cao dịch chiết HTO đỏ.
Kết quả kiểm tra bằng kính hiển vi cho thấy, dịch chiết hà thủ ơ có khả năng làm tăng sinh melanin nội bào (được chỉ bằng mũi tên màu đỏ) và melanin ngoại bào (được chỉ bằng các mũi tên màu vàng) của tế bào sinh sắc tố SK-MEL-28. Điều này mang ý nghĩa rất quan trọng, đặc biệt đối với melanin ngoại bào, bởi chính melanin này sau khi được tế bào tiết ra sẽ được chuyển tới keratinocytes và đóng vai trị trong quy định màu tóc, mắt, lơng của động vật có vú [19, 20].
Tiếp theo để định lượng melanin tổng số, chúng tôi tiến hành thu tế bào và dịch tế bào, ly tâm thu kết tủa (tế bào và melanin ngoại bào) và được định lượng bằng cách đo OD ở bước sóng 600 nm. Kết quả thu được sau khi kết tủa được trình bày trong hình 3.5 cho thấy ở các nồng độ khảo sát, dịch chiết HTO đỏ đều có khả năng làm tăng sinh tổng hợp melanin.
Hình 3.5. Sự khác biệt về hàm lượng melanin sinh ra đối với các nồng độ dịch chiết HTO đỏ khác nhau.
Chú thích: NC: Tế bào ni cấy ở điều kiện bình thường. C1: HTO nồng độ 312,5µg/ml.
C2: HTO nồng độ 625µg/ml. C4: HTO nồng độ 2500µg/ml.
Kết quả định lượng bằng phương pháp đo OD được trình bày ở biểu đồ (Hình 3.6.) cho thấy dịch chiết HTO ở các nồng độ C1 (312,5 µg/ml), C2 (625 µg/ml), và C4 (2500 µg/ml) làm tăng lượng melanin tổng số lên 2,14; 3,64 và 4,02 lần so với đối chứng, một cách tương ứng.
Hình 3.6. Biểu đồ đánh giá hàm lượng melanin tổng số.
Chú thích: NC: Tế bào ni cấy ở điều kiện bình thường. C1: HTO nồng độ 312,5µg/ml.
C2: HTO nồng độ 625µg/ml. C4: HTO nồng độ 2500µg/ml.
3.2.4. Con đường tác dụng của cao dịch chiết HTO lên sự tổng hợp melanin.
Để khảo sát cơ chế tác dụng của dịch chiết HTO lên khả năng tăng sinh tổng hợp melanin của tế bào sinh sắc tố SK-MEL-28, chúng tôi tiến hành nuôi tế bào trong các điều kiện cụ thể như sau:
Giếng 2: Tế bào nuôi cấy trong điều kiện môi trường được bổ sung ASP (agouti – là chất ức chế phân tử MC1R).
Giếng 3: Tế bào nuôi cấy trong điều kiện môi trường được bổ sung đồng thời cao dịch chiết HTO và ASP.
Sau 48 giờ nuôi cấy, tiến hành thu tế bào và dịch tế bào vào các ống khác nhau sau đó sử dụng các dịng kit thương mại để tách ARN tổng số và tổng hợp cDNA. Sử dụng mẫu cDNA để điện di phân tích sự biểu hiện của một số gene tham gia vào trong các con đường điều hòa sinh tổng hợp melanin.
Kết quả đo nồng độ ARN tổng số bằng máy đo quang phổ nanodrop được trình bày trong bảng 3.2.