Dị dạng Ngày thứ nhất Ngày thứ hai Ngày thứ ba Ngày thứ tƣ
Phù màng nỗn hồng + + + +
Phù màng bao tim + + +
Tổn thương liên quan
đến mạch máu + + +
Hình 3.12. Một số dị dạng quan sát được khi phơi nhiễm bằng methanol. Chú thích: e – phù nề (phù màng nỗn hồn/bao tim), Chú thích: e – phù nề (phù màng nỗn hồn/bao tim),
h – tổn thương liên quan đến mạch máu, n – hoại tử
Sau khi sử dụng phần mềm GraphPad phân tích số liệu thống kê số lượng cá thể cá ngựa vằn sống sót và dị dạng ở ngày thứ 4 sau khi thụ tinh, chúng tôi thu được biểu đồ sau:
Hình 3.13. Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ sống sót và tỷ lệ dị dạng khi phơi nhiễm bằng methanol ở phôi (ấu thể) cá ngựa vằn bốn ngày tuổi.
Chú thích: Tỷ lệ sống sót
Tỷ lệ dị dạng
Từ kết quả thống kê dị dạng ở bảng 3.4, chúng tôi nhận thấy rằng mức độ dị dạng gây ra bởi methanol phụ thuộc vào thời gian phơi nhiễm. Ở ngày đầu tiên, chỉ có một kiểu hình bất thường quan sát được là phù màng nỗn hồng. Đến ngày thứ hai trở đi, mức độ dị dạng tăng dần. Điều này có thể được giải thích do methanol được hòa tan và xâm nhập dần dần vào cơ thể sinh vật theo thời gian, gây ra những dị dạng ngày càng nghiêm trọng (bảng 3.4).
Theo biểu đồ biểu diễn tỷ lệ sống sót và dị dạng của cá ngựa vằn, ta thấy rằng, ảnh hưởng của methanol lên sự sinh trưởng, phát triển của phôi cá ngựa vằn phụ thuộc chặt chẽ vào nồng độ, tỷ lệ chết và dị dạng tăng dần theo chiều tăng của nồng độ methanol. Ở nồng độ 0,75%, phôi sinh trưởng hồn tồn bình thường và khơng có bất kì dị dạng nào được tìm thấy, trong khi ở nồng độ 0,95% và 1,25% đã bắt đầu xuất hiện các dị dạng mặc dù khơng có phơi (ấu thể) nào bị chết. Ở nồng độ 3%, đến ngày thứ 4 sau khi thụ tinh, phôi (ấu thể) cá ngựa vằn chết 100%. Bên cạnh đó, sự phụ thuộc của độc tính vào nồng độ methanol còn được biểu hiện ở mức độ dị dạng. Trên hình 3.12 đã chỉ rõ, tại nồng độ 0,95%, methanol gây dị dạng phôi (ấu thể) ở mức độ nhẹ: phù màng bao tim và tổn thương liên quan đến mạch máu (hình 3.12A). Trong khi đó, tại nồng độ cao hơn là 1,95%, phôi (ấu thể) cá ngựa vằn mang trên mình
hồng, tổn thương liên quan đến mạch máu và hoại tử (hình 3.12B, 3.12C, 3.12D). Từ những kết quả phân tích ở trên, có thể kết luận rằng, mức độ gây dị dạng của methanol phụ thuộc vào nồng độ và thời gian phơi nhiễm.
Một chất được coi là tác nhân gây quái thai khi tỷ số TI (LC50/EC50) > 1 [47]. Từ những số liệu thu được, các giá trị LC50 và EC50 ở ấu thể cá ngựa vằn 4 ngày sau thụ tinh cũng được tính tốn và kết quả là: LC50 (4dpf) = 2,128 %v/v; EC50 (4dpf) = 1,821 %v/v. Như vậy, methanol là chất gây quái thai ở ấu thể cá ngựa vằn 4 ngày tuổi (TI = 1,17).
Sau thí nghiệm thử độc tính với methanol, chúng tôi thu được kết quả cực kỳ quan trọng: Với nồng độ 0,75% v/v trở xuống, methanol hoàn tồn khơng gây ảnh hưởng lên q trình sinh trưởng của phôi cá ngựa vằn. Kết quả này được sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo.
3.3.2. Thử độc tính của dịch chiết của hà thủ ô đỏ trong methanol lên sự phát triển của phôi cá ngựa vằn phát triển của phôi cá ngựa vằn
Để đánh giá một cách chính xác ảnh hưởng của dịch chiết hà thủ ô đỏ trong methanol lên sự sinh trưởng của phôi cá ngựa vằn, chúng tôi sử dụng methanol nồng độ 0,75% để hòa tan cao dịch chiết hà thủ ô, đảm bảo rằng methanol không làm ảnh hưởng đến phôi cá ngựa vằn. Tương tự như methanol, khi thử độc tính dịch chiết hà thủ ô, chúng tôi đã tiến hành các thí nghiệm sơ bộ thu hẹp nồng độ và cuối cùng thử độc tính với dải nồng độ cho ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Dải nồng độ dịch chiết hà thủ ô đỏ trong methanol dùng để thử độc tính lên phơi cá ngựa vằn.
Nồng độ Dịch chiết hà thủ ô
đỏ (mg/l) 135 175 225 295 385 500 650 845
Sau khi phơi nhiễm cá ngựa vằn với mơi trường có chứa dịch chiết hà thủ ơ, ngồi các dị dạng quan sát được như khi phơi nhiễm methanol, còn xuất hiện kiểu hình thân dị thường: Đ’i cong (hình 3.14B, 3.14D, 3.14F, 3.14G).
Bảng 3.6. Bảng thống kê dị dạng gây ra bởi dịch chiết hà thủ ô trong methanol Dị dạng Ngày thứ nhất Ngày thứ hai Ngày thứ ba Ngày thứ tƣ Phù màng nỗn hồng + + + Phù màng bao tim + +
Tổn thương liên quan
đến mạch máu + +
Hoại tử + +
Đuôi cong + +
Hình 3.14. Một số dị dạng quan sát được khi phơi nhiễm bằng dịch chiết hà thủ ơ trong methanol.
Chú thích: e – phù nề (phù màng nỗn hồn/bao tim);
Phân tích số liệu thống kê về số lượng cá thể sống sót và dị dạng ở phơi (ấu thể) cá ngựa vằn 4 ngày tuổi ta có biểu đồ sau:
Hình 3.15. Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ sống sót và tỷ lệ dị dạng khi phơi nhiễm bằng dịch chiết hà thủ ô trong methanol ở phôi (ấu thể) cá ngựa vằn bốn ngày tuổi.
Chú thích: Tỷ lệ sống sót.
Tỷ lệ dị dạng
Khi phơi nhiễm phôi cá ngựa vằn bằng dịch chiết hà thủ ô trong methanol, chúng tôi thu được kết quả tương tự như khi phơi nhiễm bằng methanol: Mức độ dị dạng phụ thuộc chặt chẽ vào nồng độ và thời gian phơi nhiễm. Tuy nhiên, do dịch chiết hà thủ ơ có chứa hỗn hợp các chất có khối lượng phân tử lớn, việc vận chuyển khó khăn hơn so với methanol, do đó mà dị dạng xuất hiện muộn hơn. Ở đây, vào ngày thứ hai, phôi cá ngựa vằn bắt đầu có những biến đổi bất thường: phù màng nỗn hồng và từ ngày thứ ba trở đi, các đặc điểm dị thường khác mới xuất hiện (bảng 3.6). Mức độ dị dạng tăng dần theo thời gian phơi nhiễm còn biểu hiện rõ trên hình. Tại nồng độ 385 mg/l và 500 mg/l, ở ngày thứ tư, mức độ phù màng bao tim tăng lên rõ rệt (hình 3.14C, 3.14D, 3.14F, 3.14G). Từ biểu đồ ở hình 3.15, chúng tôi thấy rằng, 135 mg/l là nồng độ an toàn, tại đây, cá ngựa vằn sinh trưởng hồn tồn bình thường. Từ nồng độ lớn hơn 175 mg/l đã bắt đầu xuất hiện dị dạng, tuy vậy từ nồng độ 385 mg/l trở lên, phôi (ấu thể) cá ngựa vằn mới bị chết.
Giá trị LC50, EC50, EC10 của ấu thể cá ngựa vằn 4 ngày tuổi khi thử bằng dịch chiết hà thủ ơ được tính tốn và kết quả lần lượt là: 456 mg/l; 400
mg/l và 245 mg/l. Như vậy, dịch chiết hà thủ ô đỏ trong methanol cũng được coi là một tác nhân gây quái thai ở cá ngựa vằn 4 ngày tuổi (TI = 1,14).
Sau khi thử độc tính của dịch chiết hà thủ ô trong methanol lên sự sinh trưởng của phôi cá ngựa vằn, chúng tôi lựa chọn các nồng độ dưới giá trị EC10 (là nồng độ mà tại đó 10% số lượng cá thể bị dị dạng) để đánh giá hoạt tính tăng sinh tổng hợp melanin ở cá ngựa vằn.
3.3.3. Đánh giá khả năng tăng sinh tổng hợp melanin của dịch chiết hà thủ ô trong methanol lên cá ngựa vằn ở mức độ phiên mã. trong methanol lên cá ngựa vằn ở mức độ phiên mã.
Dựa vào kết quả thu được từ thí nghiệm thử độc tính của dịch chiết hà thủ ô trong methanol lên cá ngựa vằn, chúng tôi tiến hành phơi nhiễm phơi nhiễm cá ngựa vằn trong mơi trường có chứa dịch chiết hà thủ ô trong methanol với các nồng độ khác nhau được cho dưới bảng 3.7.
Bảng 3.7. Môi trường phơi nhiễm phơi cá ngựa vằn dùng cho thí nghiệm thử hoạt tính. Mẫu Mơi trƣờng Nồng độ 1 E3 2 MeOH 0,75% v/v 3 HTO/ (0,75% MeOH) 135 mg/l 4 HTO/ ( 0,75% MeOH) 225 mg/l
Sau 7 ngày phơi nhiễm, chúng tôi tiến hành thu mẫu, tinh sạch và đo hàm lượng ARN tổng số. Kết quả được trình bày trong bảng 3.8.