Nhân gen mitf
Bảng 2.9. Trình tự cặp mồi khuếch đại đoạn gen mitf.
Tên mồi Trình tự Kích thƣớc sản phẩm (bp) Fw 5’-TGTACAGCAATCATGCTCTTCC-3’ Tm= 57,2 ⁰C 176 bp Rv 5’-GTCCCCAGCTCCTTAATTCTGTC-3’ Tm= 55,2 ⁰C
Các thành phần điện di tương tự như bảng 2.9. Chu trình nhiệt tương tự như hình 2.2.
Nhân gen tyrosinase
Bảng 2.10. Trình tự cặp mồi khuếch đại đoạn gen tyrosinase.
Tên mồi Trình tự Kích thƣớc sản phẩm (bp) Fw 5’-CGCAGATGAACAATGGCTC-3’ Tm= 54,3⁰C 192 bp Rv 5’-AGCAGATACACCCGATGCC-3’ Tm= 57,3 ⁰C
2.2.3.4. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp điện di trên gel agarose để kiểm tra độ đặc hiệu của phản ứng PCR với các đoạn gen quan tâm.
Chuẩn bị gel agarose.
Sản phẩm PCR trộn đều với loading dye theo tỷ lệ 5:1 về thể tích và tra vào các giếng điện di.
Sau khi điện di, bản gel được nhuộm với ethidium bromide trong 10 phút, soi dưới tia cực tím (UV) và chụp ảnh.
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tách chiết hà thủ ô đỏ
Chúng tôi đã tiến hành tách chiết rễ hà thủ ô đỏ cung cấp từ Viện dược liệu theo quy trình chiết rút các chất tự nhiên bằng ba loại dung môi n-hexan, ethyl acetate và methanol và thu được kết quả được cho dưới bảng 3.1.
Bảng 3.1. Khối lượng các cao dịch chiết thu được từ bột khô rễ HTO đỏ.
Dung môi Khối lƣợng cao dịch chiết (…g/5g bột)
n- Hexan 0,0536
Ethyl acetate 0,0292
Methanol 1,2864
Chúng tôi chọn ba loại dung mơi n-hexan, ethyl acetate, methanol có độ phân cực tăng dần, tương ứng là 0,0; 4,4; 5,1 [56] để tách chiết bột hà thủ ơ đỏ. Chính vì thế mà chúng có thể hịa tan được rất nhiều các nhóm chất khác nhau có trong hà thủ ơ. n-Hexane là dung môi không phân cực, sẽ chiết rút được các hợp chất không phân cực, chẳng hạn như các loại dầu. Ethyl acetate có độ phân cực là 4,4, do đó nó có khả năng hịa tan các chất có độ phân cực khá lớn, ví dụ như các keton. Methanol có độ phân cực cao nhất, vì vậy mà có thể hịa tan các chất có tính phân cực cao như các chất có chứa nhóm –OH hay –NH2.
Từ bảng kết quả trên, ta thấy rằng lượng cao dịch chiết thu được khi tách chiết 5 g bột hà thủ ô đỏ bằng dung môi methanol là cao nhất, cao gấp 44 lần so với tách bằng ethyl acetate và 24 lần so với tách bằng n-hexan. Điều này chứng tỏ rằng, rễ hà thủ ô đỏ chứa một hàm lượng khá lớn các hợp chất có tính phân cực.
3.2. Kết quả nghiên cứu in vitro.
3.2.1. Kết quả hoạt hóa và nhân ni tế bào.
Tế bào melanoma SK-MEL-28 được hoạt hóa và nhân ni trong mơi trường DMEM chứa 10% FBS và 1% streptomycin, ở điều kiện 37˚C, 5% CO2. Sau khi
nuôi cấy, chúng tôi tiến hành cấy chuyển, nhân nuôi tế bào số lượng lớn nhằm mục đích phục vụ cho các thí nghiệm sau. Hình 3.1 là ảnh chụp tế bào SK-MEL-28 chụp ở vật kính 10, độ phóng đại 5,6X sau 24 giờ hoạt hóa.
Hình 3.1. Tế bào SKMEL-28 (sau 24h hoạt hóa).
Hình ảnh cho thấy, chúng tơi đã thành cơng trong việc hoạt hóa và nhân ni dịng tế bào SK-MEL-28 chuẩn bị cho các thí nghiệm sau.
3.2.2. Độc tính của cao dịch chiết hà thủ ơ đỏ đối với sự sinh trưởng của tế bào SK-MEL-28. SK-MEL-28.
Những chất có mang hoạt tính sinh học thường là những hợp chất phân cực mạnh, do vậy chúng tôi sử dụng dịch chiết hà thủ ô đỏ trong methanol để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.
Đầu tiên, chúng tôi tiến hành khảo sát độc tính của cao dịch chiết HTO đỏ `trong methanol đối với sự sinh trưởng của tế bào như sau:
Chúng tôi tiến hành nuôi cấy tế bào SK-MEL-28 trong đĩa 6 giếng. Sau 24 giờ, tế bào ổn định, bám dính ở bề mặt đĩa ni cấy, chúng tôi tiến hành tra các cao dịch chiết đã pha trong DMSO (nồng độ DMSO nhỏ hơn 0,05% để không ảnh hưởng đến tế bào) với các nồng độ từ C1 đến C5 trong các giếng tương ứng là 312,5µg/ml; 625µg/ml; 1250µg/ml; 2500µg/ml; 5000µg/ml và sử dụng một giếng làm đối chứng (NC), giếng đối chứng được nuôi cấy với mơi trường có 0,05% DMSO.
Sau khi tra thuốc 24h, tiến hành nhuộm tím tinh thể, chúng tơi thu được hình ảnh (hình 3.2).
Hình 3.2. Tế bào sau khi bổ sung cao dịch chiết HTO ở các nồng độ khác nhau.
Chú thích: NC: Tế bào ni cấy trong mơi trường có bổ sung 0,05% DMSO. C1: HTO nồng độ 312,5µg/ml. C2: HTO nồng độ 625µg/ml. C3: HTO nồng độ 1250µg/ml. C4: HTO nồng độ 2500µg/ml. C5: HTO nồng độ 5000µg/ml.
Sau khi chụp ảnh tế bào (hình 3.2), chúng tơi tiến hành hịa tan tế bào trong dung dịch SDS 10% và đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 530 nm. Từ kết quả đo OD, chúng tôi tiến hành xây dựng biểu đồ 1 nhằm đánh giá độc tính của cao dịch chiết HTO đối với tế bào.
Chú thích: NC: Tế bào ni cấy ở mơi trường có bổ sung 0,05% DMSO. C1: HTO nồng độ 312,5µg/ml. C2: HTO nồng độ 625µg/ml. C3: HTO nồng độ 1250µg/ml. C4: HTO nồng độ 2500µg/ml. C5: HTO nồng độ 5000µg/ml.
Dựa vào kết quả thu được từ biểu đồ hình 3.3, chúng tôi nhận thấy ở các nồng độ 312,5 µg/ml, 625 µg/ml, và 1250 µg/ml cao dịch chiết HTO đỏ không gây độc tế bào. Tuy nhiên, ở các nồng độ 2500 µg/ml và 5000 µg/ml, dịch chiết HTO đỏ gây chết 16.2% và 21.6% số lượng tế bào so với đối chứng, một cách tương ứng.
Kết luận:
Cao dịch chiết HTO ở nồng độ nhỏ hơn 5000 µg/ml có độc tính thấp, an tồn với tế bào.
Khi xác định được nồng độ cao dịch chiết ảnh hưởng đến tế bào trong dải nồng độ trên, chúng tôi không tiếp tục thử ở các nồng độ cao hơn và tiến hành xác định ảnh hưởng của cao dịch chiết lên sự tăng sinh tổng hợp melanin của dòng tế bào này ở các nồng độ nhỏ hơn 5000 µg/ml.
3.2.3. Ảnh hưởng của cao dịch chiết lên sự tăng sinh tổng hợp melanin của các tế bào SK-MEL-28. tế bào SK-MEL-28.
Tiếp theo chúng tôi khảo sát khả khả năng kích thích tăng sinh tổng hợp melanin của dịch chiết HTO trên tế bào. Tế bào (105 tế bào) được bổ sung vào các giếng của đĩa 6 giếng và ni trong điều kiện mơi trường bình thường (10% FBS) trong 24 giờ, sau đó tiến hành thay mơi trường bình thường (10% FBS) bằng môi trường nghèo dinh dưỡng (0.5% FBS) và tiếp tục nuôi trong 8 giờ trước khi một lần nữa thay bằng mơi trường bình thường (10% FBS) có bổ sung cao dịch chiết ở các nồng C1 (312,5 µg/ml), C2 (625 µg/ml), và C4 (2500 µg/ml) (giếng đối chứng âm không bổ sung cao dịch chiết) và tiếp tục ni cấy trong 48 giờ. Sau đó đĩa tế bào được mang đi chụp ảnh dưới kính hiển vi để xem sự xuất hiện của melanin nội vào ngoại bào (hình 3.4.).
Hình 3.4. Tế bào sản sinh melanin nội bào và ngoại bào
Chú thích: NC: tế bào đối chứng, không bổ sung cao dịch chiết HTO đỏ. HTO: tế bào nuôi cấy được bổ sung cao dịch chiết HTO đỏ.
Kết quả kiểm tra bằng kính hiển vi cho thấy, dịch chiết hà thủ ơ có khả năng làm tăng sinh melanin nội bào (được chỉ bằng mũi tên màu đỏ) và melanin ngoại bào (được chỉ bằng các mũi tên màu vàng) của tế bào sinh sắc tố SK-MEL-28. Điều này mang ý nghĩa rất quan trọng, đặc biệt đối với melanin ngoại bào, bởi chính melanin này sau khi được tế bào tiết ra sẽ được chuyển tới keratinocytes và đóng vai trị trong quy định màu tóc, mắt, lơng của động vật có vú [19, 20].
Tiếp theo để định lượng melanin tổng số, chúng tôi tiến hành thu tế bào và dịch tế bào, ly tâm thu kết tủa (tế bào và melanin ngoại bào) và được định lượng bằng cách đo OD ở bước sóng 600 nm. Kết quả thu được sau khi kết tủa được trình bày trong hình 3.5 cho thấy ở các nồng độ khảo sát, dịch chiết HTO đỏ đều có khả năng làm tăng sinh tổng hợp melanin.
Hình 3.5. Sự khác biệt về hàm lượng melanin sinh ra đối với các nồng độ dịch chiết HTO đỏ khác nhau.
Chú thích: NC: Tế bào ni cấy ở điều kiện bình thường. C1: HTO nồng độ 312,5µg/ml.
C2: HTO nồng độ 625µg/ml. C4: HTO nồng độ 2500µg/ml.
Kết quả định lượng bằng phương pháp đo OD được trình bày ở biểu đồ (Hình 3.6.) cho thấy dịch chiết HTO ở các nồng độ C1 (312,5 µg/ml), C2 (625 µg/ml), và C4 (2500 µg/ml) làm tăng lượng melanin tổng số lên 2,14; 3,64 và 4,02 lần so với đối chứng, một cách tương ứng.
Hình 3.6. Biểu đồ đánh giá hàm lượng melanin tổng số.
Chú thích: NC: Tế bào ni cấy ở điều kiện bình thường. C1: HTO nồng độ 312,5µg/ml.
C2: HTO nồng độ 625µg/ml. C4: HTO nồng độ 2500µg/ml.
3.2.4. Con đường tác dụng của cao dịch chiết HTO lên sự tổng hợp melanin.
Để khảo sát cơ chế tác dụng của dịch chiết HTO lên khả năng tăng sinh tổng hợp melanin của tế bào sinh sắc tố SK-MEL-28, chúng tôi tiến hành nuôi tế bào trong các điều kiện cụ thể như sau:
Giếng 2: Tế bào nuôi cấy trong điều kiện môi trường được bổ sung ASP (agouti – là chất ức chế phân tử MC1R).
Giếng 3: Tế bào nuôi cấy trong điều kiện môi trường được bổ sung đồng thời cao dịch chiết HTO và ASP.
Sau 48 giờ nuôi cấy, tiến hành thu tế bào và dịch tế bào vào các ống khác nhau sau đó sử dụng các dịng kit thương mại để tách ARN tổng số và tổng hợp cDNA. Sử dụng mẫu cDNA để điện di phân tích sự biểu hiện của một số gene tham gia vào trong các con đường điều hòa sinh tổng hợp melanin.
Kết quả đo nồng độ ARN tổng số bằng máy đo quang phổ nanodrop được trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả đo nanodrop của RNA tổng số tách được từ tế bào
Mẫu Nồng độ (µg/ml)
1 410.6
2 453.2
3 317.0
Giả thiết rằng sự tác dụng của cao dịch chiết hà thủ ơ đỏ đi theo con đường chính thống nhất đã được tìm hiểu từ các nghiên cứu khoa học trước đó là con đường MC1R/MITF/tyrosinase, chúng tôi đã tiến hành PCR với các đoạn mồi đặc hiệu MC1R, MITF và tyrosinase, cuối cùng điện di kiểm tra kết quả, thu được kết quả như trong hình 3.7, hình 3.8, hình 3.9.
Hình 3.7. Mức độ biểu hiện của gene giữ nhà GAPDH của cDNA các mẫu tế bào melanoma.
Chú thích: NC: Mẫu đối chứng.
Giếng 1: Mẫu cDNA tế bào nuôi cấy ở điều kiện thường. Giếng 2: Mẫu cDNA tế bào bổ sung ASP.
Giếng 3: Mẫu cDNA tế bào vừa bổ sung ASP vừa bổ sung HTO
Hình ảnh điện di với cặp mồi GAPDH được trình bày như hình 3.7. Kết quả cho thấy các băng xuất hiện rõ nét, độ sáng tương đương nhau, kích thước khoảng 366bp đúng với kích thước đoạn AND của gen như mong muốn.
Trong sinh học phân tử, gen giữ nhà là cần thiết trong việc duy trì tất cả các chức năng cơ bản của tế bào được thể hiện trong tất cả các tế bào ở điều kiện sinh lý bình thường. Gen GAPDH được thể hiện trên mọi tế bào, không phụ thuộc vào thể loại, trạng thái hoạt động hay nguồn gốc nên được dùng như một gen nội chuẩn để đánh giá mẫu.
Hình ảnh điện di GAPDH cho thấy chất lượng các mẫu tốt, đảm bảo tiêu chuẩn cho phản ứng, đồng thời khơng có sự khác biệt về lượng mẫu đã sử dụng trong mỗi phản ứng PCR.
200bp 500bp
Hình 3.8. Mức độ biểu hiện của gene MC1R của cDNA các mẫu tế bào melanoma.
Chú thích: NC: Mẫu đối chứng.
Giếng 1: Mẫu cDNA tế bào nuôi cấy ở điều kiện thường. Giếng 2: Mẫu cDNA tế bào bổ sung ASP.
Giếng 3: Mẫu cDNA tế bào vừa bổ sung ASP vừa bổ sung HTO.
Hình ảnh điện di với cặp mồi MC1R được trình bày trong hình 3.8. Kết quả cho thấy, chỉ xuất hiện 1 băng ở giếng số 1, với kích thước đúng với đoạn gen nhân lên khoảng 133bp. Trong khi đó ở giếng thứ 2 và 3 hầu như khơng thấy xuất hiện băng. Điều này chứng tỏ ASP đã ức chế sự biểu hiện của MC1R và dịch chiết hà thủ ơ đỏ khơng có khả năng làm tái hoạt MC1R khi nó đã bị ức chế bởi ASP.
200bp 100bp
Hình 3.9. Mức độ biểu hiện của gene MITF (A) và tyrosinase (B) của cDNA các mẫu tế bào melanoma
Chú thích: NC: Mẫu đối chứng.
Giếng 1: Mẫu cDNA tế bào nuôi cấy ở điều kiện thường. Giếng 2: Mẫu cDNA tế bào bổ sung ASP.
Giếng 3: Mẫu cDNA tế bào vừa bổ sung ASP vừa bổ sung HTO.
Hình ảnh điện di với mồi MITF và tyrosinase được trình bày trong hình 3.9. Trong hình 3.9 xuất hiện các băng điện di với mồi MITF, kích thước đúng khoảng 121bp và với mồi tyrosinase, kích thước khoảng 111bp đúng như mong muốn ở giếng số 1 và giếng số 3 mà không xuất hiện ở giếng số 2. Điều này cho thấy rằng ASP làm ức chế sự biểu hiện của MC1R (hình 3.9, giếng số 2) và dẫn tới sự suy giảm biểu hiện của MITF và tyrosinase (hình 3.9, các giếng số 2). Một điều rất thú vị đó là mặc dù dịch chiết hà thủ ơ khơng có khả năng kích hoạt sự biểu hiện của MC1R sau khi đã bị ức chế bởi ASP (hình 3.9, giếng số 3), nhưng nó lại làm cho sự biểu hiện tăng trở lại của MITF và tyrosinase (hình 3.9, các giếng số 3) sau khi nó bị ức chế bởi ASP (hình 3.9, các giếng số 2).
200bp 100bp
Kết luận:
Các kết quả được trình bày trong các hình 3.8 và hình 3.9 chỉ ra rằng cao dịch chiết hà thủ ơ có khả năng làm tăng sinh tổng melanin thông qua khả năng tác động và làm tăng sự biểu hiện của MITF và tyrosinase mà khơng ảnh hưởng đến thụ thể MC1R.
Như vậy có thể giả thiết rằng dịch chiết hà thủ ơ tác động một cách trực tiếp lên sự biểu hiện của MITF và tyrosinase hoặc gián tiếp qua các phân tử tín hiệu khác với cơ chế chưa rõ. Vì vậy, chúng tơi tiếp tục tiến hành đề tài này bằng việc thực hiện đánh giá cơ chế phân tử tác dụng của cao dịch chiết HTO đỏ trong methanol thông qua con đường thứ hai đã được nhắc đến ở trên, con đường RAS /RAF /MEK /ERK /MITF /Tyrosinase. Thực hiện phản ứng PCR với các đoạn mồi đặc hiệu là Nras và ERK, sau đó tiến hành kiểm tra bằng phương pháp điện di thu được kết quả như hình 3.10, hình 3.11.
Hình 3.10. Mức độ biểu hiện của gene Nras (120bp) của cDNA các mẫu tế bào melanoma
Chú thích: NC: Mẫu đối chứng.
Giếng 1: Mẫu cDNA tế bào nuôi cấy ở điều kiện thường. Giếng 2: Mẫu cDNA tế bào bổ sung ASP.
Giếng 3: Mẫu cDNA tế bào vừa bổ sung ASP vừa bổ sung HTO
200bp
Hình ảnh điện di với mồi Nras được trình bày trên hình 3.10. Hình 3.10 xuất hiện 3 băng với kích thước khoảng 120bp, đúng với kích thước gene quan tâm.
Hình 3.11. Mức độ biểu hiện của gene ERK của cDNA các mẫu tế bào melanoma
Chú thích: NC: Mẫu đối chứng.
Giếng 1: Mẫu cDNA tế bào nuôi cấy ở điều kiện thường. Giếng 2: Mẫu cDNA tế bào bổ sung ASP.
Giếng 3: Mẫu cDNA tế bào vừa bổ sung ASP vừa bổ sung HTO.
Hình 3.11 thể hiện hình ảnh điện di với mồi ERK. Trên hình xuất hiện 3 băng với kích thước đúng với mong muốn khoảng 186bp.
Các hình 3.10 và 3.11 là kết quả điện di với các cặp mồi lần lượt là Nras và ERK. Kết quả thu được cho thấy, các băng điện di xuất hiện ở tất cả các giếng 1, 2 và 3, tuy nhiên cường độ tín hiệu ở các giếng số 1 và 3 là mạnh hơn so với cường độ tín hiệu ở giếng số 2, đặc biệt là trong trường hợp của gen Nras. Điều này chỉ ra rằng, ASP ngoài khả năng ức chế MC1R thì nó cũng có khả năng làm ức chế biểu hiện của Nras. Điều này cũng dễ hiển bởi vì giữa các thụ thể màng tế bào MC1R và Nras có mối liên hệ thông qua sự hoạt động của các G-protein như đã trình bày