Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu

CHƢƠNG 2 : ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2. Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Tách chiết hợp chất hữu cơ từ rễ cây hà thủ ô đỏ.

 Phương pháp:

Ly trích (chiết) là phương pháp dùng một dung môi (đơn hay hỗn hợp) để tách lấy mơt chất hay một nhóm các chất từ hỗn hợp cần nghiên cứu [10].

 Nguyên tắc

Dựa vào tính phân cực của dung mơi và của các nhóm chất ta có thể dự đốn sự có mặt của các chất trong mỗi phân đoạn li trích.

Quy tắc chung: Các dung mơi phân cực hồ tan các hợp chất phân cực tốt nhất và các dung môi khơng phân cực hịa tan các hợp chất khơng phân cực tốt nhất. Các hợp chất phân cực mạnh như các loại đường (ví dụ như đường mía) hoặc các hợp chất ion, như các muối vô cơ (ví dụ như muối ăn) chỉ hòa tan trong các dung môi phân cực mạnh như nước, trong khi các hợp chất không phân cực mạnh như dầu hoặc sáp chỉ tan trong các dung môi hữu cơ không phân cực mạnh như hexane [7, 25].

Quy trình tách chiết bột hà thủ ô bằng các dung mơi hữu cơ được trình bày ở sơ đồ dưới đây:

Các bước tiến hành

- Rễ hà thủ ô phơi khô, nghiền thành dạng bột mịn.

- Lấy 5g mẫu bột, thêm 100ml dung mơi n-hexan sau đó siêu âm phá vỡ tế bào trong 15 phút rồi khuấy từ trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau 1 giờ, thu hỗn hợp đem li tâm với tốc độ 6000rpm trong 5 phút ở 250C, lọc và thu dịch chiết n-hexane lần một cùng với cặn.

- Cặn thu được sẽ thêm 100ml n-hexan vào, tiếp tục khuấy từ và li tâm tương tự như trên, thu được dịch chiết n-hexan lần hai và cặn.

- Cặn sẽ được làm bay hơi dung mơi n-hexan hồn tồn và tiếp tục khuấy từ trong dung mơi ethylacetate. Q trình lặp lại như với dung môi n-hexan để thu được dịch chiết ethylacetate.

- Cặn sẽ được tiếp tục khuấy từ trong methanol ở ngày tiếp theo để thu được dịch chiết methanol.

- Các dịch chiết được thu lại trong các bình thủy tinh và đem cơ quay thu cao khô bằng máy cô quay chân không. Mỗi dịch chiết thu được các cao khô tương ứng. Cao dịch chiết được bảo quản lạnh để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.

2.2.2. Khảo sát tác dụng của các dịch chiết lên khả năng sinh tổng hợp melanin ở mức độ in vitro

2.2.2.1. Đối tượng nghiên cứu

Tế bào Sk-mel-28 là dòng tế bào ung thư da được phân lập từ một hạch bạch huyết ở nách của một nam giới 51 tuổi không rõ chủng tộc. Dịng Sk-mel-28 có chu

kì phân chia là 28h, được nhân ni trong trường DMEM có bổ sung 10% huyết thanh bào thai bò (FBS) ở điều kiện 37oC trong 5% CO2, 95% không khí.

Nuôi cấy tế bào

- Pha môi trường nuôi cấy theo tỉ lệ: 90-10-1 (90% DMEM, 10% FBS và 1% Peniciline/Streptomicin).

- Tế bào được bảo quản trong bình nitơ lỏng hoặc tủ -80º C, lấy đem rã đông trong tủ ổn nhiệt 37º C.

- Đổ dung dịch chứa tế bào vào 5-7 ml mơi trường ni cấy, sục đều sau đó cho vào đĩa peptri 100mm ủ trong tủ ấm 37º C, 5% CO2.

- Kiểm tra hằng ngày, thay môi trường 2 ngày/lần, khi tế bào mọc kín 75- 90% bề mặt đĩa thì thu hoặc cấy chuyển tế bào sang đĩa mới.

- Thu tế bào từ đĩa nuôi cấy bằng cách ủ với dung dịch trypsine 1X trong 1-2 phút ở 37º C, 5% CO2, sau đó bất họat trypsine bằng cách bổ sung mơi trường nuôi cấy theo tỷ lệ 1:1, hút dịch vào ống ly tâm, ly tâm 1300 rpm trong 5 phút.

- Kiểm tra tỷ lệ sống chết của tế bào bằng cách nhuộm với thuốc nhuộm blue trypan tỷ lệ 1:1 trong 3-5 phút rồi đem đếm số lượng bằng buồng đếm tế bào.

2.2.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết hà thủ ô đỏ trong methanol đối với sự phát triển của tế bào

 Hóa chất, dụng cụ thí nghiệm

- Mơi trường ni cấy tế bào DMEM - PBS 1X

- Trypsine - DMSO

- Đĩa nuôi cấy tế bào - Buồng đếm

- Kính hiển vi.  Chuẩn bị tế bào

- Nuôi cấy tế bào trên đĩa petri, với thành phần môi trường chuẩn bị trước. - Hút dịch, thêm 2ml trypsin 0,25% và ủ trong 37º C từ 1-5 phút cho tới khi các tế bào nổi trên mặt đĩa.

- Hút tất cả vào ống falcon thể tích 15ml. Ly tâm 1300rpm trong 5 phút. - Thu các tế bào sau ly tâm. Đếm số lượng tế bào bằng buồng đếm hồng cầu, xác định mật độ tế bào.

 Tra tế bào lên đĩa - Chuẩn bị 2 đĩa 24 giếng.

- Tiến hành tra tế bào vào trong các giếng 24 giếng sao cho mỗi giếng có 2.104 tế bào trong 1ml môi trường nuôi cấy.

- Nuôi tế bào trên đĩa 24 giếng ở 37º C, 5% CO2 trong 24h để tế bào ổn định. Sau đó ủ với thuốc.

- Chuẩn bị dịch chiết.

- Pha loãng cao dịch chiết ở 5 nồng độ khác nhau từ C1 đến C5 tương ứng là: 312,5 µg/ml; 625 µg/ml; 1250 µg/ml; 2500 µg/ml; 5000µg/ml.

- Cao dịch chiết được hịa tan trong DMSO, pha thuốc sao cho nồng độ cuối cùng của DMSO trong mỗi giếng nhỏ hơn 0.05%.

- Hút bỏ 0,2ml môi trường từ mỗi giếng sau đó bổ sung lại vào mỗi giếng 0,2ml dung dịch thuốc thử rồi lắc nhẹ để thuốc phân bố đều trong giếng.

- Ủ đĩa 24 giếng 24h trong tủ 37º C, 5% CO2

- Quan sát và chụp ảnh.

2.2.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết hà thủ ô đỏ đối với khả năng tăng sinh tổng hợp melanin của dòng tế bào SK-MEL-28.

Sử dụng các nồng độ cao dịch chiết trong methanol không gây độc tới tế bào (đã khảo sát được ở thí nghiệm 2.2.2.3) để đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết hà thủ ô trong methanol lên khả năng tăng sinh tổng hợp melanin.

Dụng cụ thí nghiệm, hóa chất và các bước tiến hành tương tự như thí nghiệm 2.2.2.3.

2.2.2.5. Khảo sát tác động cao dịch chiết hà thủ ô đỏ lên con đường sinh tổng hợp melanin.

Để có thể xác định được tác động của cao dịch chiết hà thủ ô đỏ là đi theo con đường nào, chúng tôi tiến hành nuôi cấy tế bào SK-MEL-28, khi tế bào ổn định và đạt đủ yêu cầu về số lượng, chúng tôi tra các tế bào với mật độ cần thiết vào các giếng như sau:

 Giếng 2: Tế bào nuôi cấy trong điều kiện môi trường được bổ sung ASP (agouti – là chất ức chế phân tử MC1R).

 Giếng 3: Tế bào nuôi cấy trong điều kiện môi trường vừa được bổ sung ASP vừa được bổ sung cao dịch chiết Hà thủ ô đỏ.

Tiến hành thu tế bào và dịch tế bào vào các ống khác nhau sau đó sử dụng các dịng kit thương mại để tách ARN tổng số và tổng hợp cDNA.

2.2.2.6. PCR với mồi đặc hiệu với các gen GAPDH, MC1R, MITF, Tyrosinase, ERK, BRAF và NRAS.

 Nguyên tắc

Nguyên tắc của phương pháp là tạo lượng lớn các đoạn DNA đặc thù từ DNA khuôn dựa trên cơ sở hoạt động của DNA-polymerase để tổng hợp sợi mới bổ sung [3].

 Thành phần tham gia

Các yếu tố cơ bản để thực hiện phản ứng PCR bao gồm: - Sợi khuôn DNA, ở đây chúng tôi sử dụng khuôn là cDNA.

- Mồi xuôi và mồi ngược của các gene GAPDH, MC1R, MITF, Tyrosinase, ERK, BRAF và NRAS có trình tự như sau:

Bảng 2.4. Các đoạn mồi đặc hiệu sử dụng trong thí nghiệm.

Mồi Trình tự Tm

GAPDH

Mồi xi: 5’-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3’ Mồi ngược: 5’-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3’

Tm = 58.9ºC Tm = 60.8ºC

MC1R

Mồi xuôi: 5’- ACTCCGTCTGCTCCAATG-3’ Mồi ngược: 5’-GCTGTGGGAGTAGCTCTTGG-5’

Tm = 57ºC Tm = 57.6ºC

MITF

Mồi xuôi: 5’- CCGTCTCTCACTGGATTGGT-3’

Mồi ngược: 5’-TGGGCTTGCTGTATGTGGTA-3’ Tm = 56.5oC

Tyrosinase

Mồi xuôi: 5’- TTGCCTGAGTTTGACCCAAT-3’ Mồi ngược: 5’-GCATCCGCTATCCCAGTAAG-3’

Tm = 54.8oC Tm = 56.2 oC

Nras

Mồi xuôi: 5’-CACACCCCCAGGATTCTTAC- 3’ Mồi ngược: 5’- GGCAAATACACAGAGGAAGC- 3’

Tm = 55.1ºC Tm = 55.3ºC

ERK

Mồi xuôi: 5’- CCTAAGGAAAAGCTCAAAGA-3’

Mồi ngược: 5’-AAGTGGATAAGCCAAGAC-3’ Tm= 49.8ºC - Các loại nucleotide dATP, dTTP, dGTP, dCTP.

- Môi trường đệm cung cấp ion Mg (Taq Buffer) và nước tinh khiết khơng có enzyme RNase và DNase.

- Enzyme chịu nhiệt Thermus aquaticus (Taq Pol). Tổng thể tích cho một phản ứng PCR là 25μl.

Thể tích và nồng độ các yếu tố của phản ứng PCR như sau:

Bảng 2.5. Các thành phần phản ứng PCR trong nghí nghiệm in vitro.

Yếu tố Thể tích (µl) Nồng độ cuối cùng trong phản ứng

Taq Buffer 10X 2,5 1X

dNTPs 2,5 8mM

Mồi xuôi 1 0,4pmol

Mồi ngược 1 0,4pmol

Taq pol 0,3 0,2u/µl

H2O 15.7

2.2.3. Khảo sát tác dụng của các dịch chiết lên khả năng sinh tổng hợp melanin ở mức độ in vivo.

2.2.3.1. Thử độc tính lên phơi cá ngựa vằn.

 Nuôi, ghép cá và thu phôi

Cá ngựa vằn trưởng thành được nuôi ở điều kiện chu kỳ sáng tối là 14:10 giờ ở 28˚C tại Phịng Thí nghiệm động vật – Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội.

Ghép cá: Trước khi cho cá đẻ một ngày, cá đực và cá cái được đặt vào chung

một bể có sẵn lưới ngăn cách tránh việc cá sinh sản quá sớm. Buổi sáng ngày hôm sau, lưới được rút ra tạo điều kiện cho cá đẻ trứng và trứng được thụ tinh. Phôi cá được thu sau khoảng hai tiếng và đặt trong môi trường E3 (5mM NaCl; 0,17 mM KCl; 0,4 mM CaCl2; 0,16 mM MgSO4) có chứa 0,01‰ Methylene Blue.

Chọn phôi: Sau 3-4 giờ ngay sau khi thụ tinh, phơi được chọn dưới kính hiển

vi quang học, loại bỏ các phôi không được thụ tinh hoặc các phơi khác thường. Lượng phơi bình thường thu được chia vào đĩa 6 giếng (25 phôi mỗi giếng) cho các thí nghiệm tiếp theo.

 Thử độc tính của dung mơi và dịch chiết hà thủ ô lên sự sinh trƣởng của phôi cá ngựa vằn

Thử độc tính của các dung môi dùng để chiết hà thủ ô đỏ lên sự phát triển của cá ngựa vằn thông qua đánh giá tỷ lệ chết, tỷ lệ dị dạng của phôi. Sau khi chọn phôi, môi trường E3 ở mỗi giếng được thay thế bởi các dung môi với các nồng độ khác nhau, phôi được giữ ở 28˚C, thử độc tính và quan sát liên tục trong 4 ngày sau thụ tinh. Dị dạng được đánh giá bằng cách xác định tỷ lệ phôi/ ấu thể với bất kì khiếm khuyết nào về hình thái trên tổng số các phơi sống sót. Các đặc điểm hình thái được so sánh với các giai đoạn tương ứng như đã mô tả trước đây của Kimmel và cộng sự năm 1995 [1, 29]. Các đặc điểm gây chết trong quá trình phơi nhiễm phôi với dung dịch thử được đánh giá theo tiêu chuẩn OECD [46] được cho dưới bảng 2.6.

Bảng 2.6. Các đặc điểm gây chết trong q trình phơi nhiễm phơi.

Điểm gây chết Thời gian phơi nhiễm

24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ

Sự đơng tụ nỗn hồng + + + +

Khơng hình thành thể đốt + + + +

Đi khơng tách ra khỏi nỗn hồng + + + +

Khơng có nhịp tim + + +

Với mỗi chất thử, các thí nghiệm sơ bộ được tiến hành để xác định dải nồng độ gây chết và dị dạng, sau đó thử nghiệm với 5-7 nồng độ trong dải nồng độ đó. Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần với 20 phôi mỗi nồng độ trên một lần thử, đồng thời chụp ảnh các dị dạng đặc trưng quan sát được. Dữ liệu được tính tốn bằng cơng cụ GraphPad Prism và từ đó xác định các chỉ số LC50, EC50 (LC50 là nồng độ tại đó 50% số lượng cá thể bị chết, EC50 là nồng độ tại đó 50% số lượng cá thể bị dị dạng).

2.2.3.2. Thử hoạt tính của dịch chiết hà thủ ô lên sự sinh tổng hợp melanin của phôi cá ngựa vằn.

 Thu mẫu và tách chiết ARN tổng số.

Phôi cá ngựa vằn được phơi nhiễm với dịch chiết hà thủ ơ đã hịa tan trong methanol và thu ở giai đoạn cá 7 ngày tuổi, đựng trong ống eppendorf.

Sau đó sử dụng các dịng kit thương mại để tách ARN tổng số và tổng hợp cDNA.

2.2.3.3. PCR với mồi đặc hiệu với các gen ef1α, mitf và tyrosinase.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng các cặp mồi đặc hiệu nhân các đoạn gen ef1α, mitf và tyrosinase từ sản phẩm cADN được tổng hợp ở trên.

 Nhân gen ef1α

Bảng 2.7. Trình tự cặp mồi khuếch đại đoạn gen ef1α.

Tên mồi Trình tự Kích thƣớc sản phẩm (bp) Fw 5’-CTGGAGGCCAGCTCAAACAT-3’ Tm= 57,7 ⁰C 202 bp Rv 5’-ATCAAGAAGAGTAGTACCGCTAGCATTAC-3’

Bảng 2.8. Các thành phần của phản ứng PCR trong thí nghiệm vi vitro. Thành phần Thể tích (μl) Thành phần Thể tích (μl) Taq Buffer 2,5 dNTP 2,5 Fw 1 Rv 1 Taq polymerase 0,2

Khuôn ADN Tùy vào nồng độ khuôn

Nước Thêm vào một lượng sao cho tổng thể tích là 25 μl mỗi phản ứng

Chu trình nhiệt:

Hình 2.2. Chu trình nhiệt PCR.

 Nhân gen mitf

Bảng 2.9. Trình tự cặp mồi khuếch đại đoạn gen mitf.

Tên mồi Trình tự Kích thƣớc sản phẩm (bp) Fw 5’-TGTACAGCAATCATGCTCTTCC-3’ Tm= 57,2 ⁰C 176 bp Rv 5’-GTCCCCAGCTCCTTAATTCTGTC-3’ Tm= 55,2 ⁰C

Các thành phần điện di tương tự như bảng 2.9. Chu trình nhiệt tương tự như hình 2.2.

 Nhân gen tyrosinase

Bảng 2.10. Trình tự cặp mồi khuếch đại đoạn gen tyrosinase.

Tên mồi Trình tự Kích thƣớc sản phẩm (bp) Fw 5’-CGCAGATGAACAATGGCTC-3’ Tm= 54,3⁰C 192 bp Rv 5’-AGCAGATACACCCGATGCC-3’ Tm= 57,3 ⁰C

2.2.3.4. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp điện di trên gel agarose để kiểm tra độ đặc hiệu của phản ứng PCR với các đoạn gen quan tâm.

 Chuẩn bị gel agarose.

 Sản phẩm PCR trộn đều với loading dye theo tỷ lệ 5:1 về thể tích và tra vào các giếng điện di.

 Sau khi điện di, bản gel được nhuộm với ethidium bromide trong 10 phút, soi dưới tia cực tím (UV) và chụp ảnh.