1.5.2 .Các vitamin
b. Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Chuyển gen vào thực vật thông qua Agrobacterium tumefaciens được xem là
phương pháp có nhiều ưu điểm (nhất là đối với cây hai lá mầm) dựa vào khả năng chuyển gen tự nhiên của loài vi khuẩn đất Agrobacterium.
1.7. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô sẹo phôi hóa tạo hệ thống tái sinh và chuyển gen vào sắn
Năm 1996, 3 nhóm nghiên cứu độc lập đồng thời cơng bố kết quả chuyển gen thành công vào cây sắn (Li và cs, 1996; Raemakers và cs, 1996; Schöpke và cs, 1996). Li và cs đã đưa ra được phương pháp tái sinh hiệu quả cây con từ mô sẹo của cây sắn chuyển gen sau khi đồng nuôi cấy với Agrobacterium tumefaciens, mở ra hướng mới trong việc cải thiện chất lượng giống sắn và tạo giống mới, thông qua các phương pháp công nghệ sinh học [36]. Reamakersvà các cộng sự đã tạo được mơ sẹo phơi hóa của các giống sắn TMS 60444, Adira 4, Thai 5 and M7, từ đó tạo được cây sắn hồn chỉnh từ các mơ này. Đặc biệt, nghiên cứu đã làm giảm đáng kể quá trình hình thành cây từ mô sẹo của giống sắn TMS60444 mang gen chuyển bằng cả 2 kĩ thuật, thông qua hệ thống Agrobacterium tumefaciens và súng bắn gen [48], [49]. Trong khi đó,
phương pháp của Schưpke và cộng sự đã thiết lập được quy trình chuyển gen vào cây sắn, thông qua kĩ thuật bắn gen mục tiêu vào mơ sẹo nhằm tạo ngun liệu cho q trình chọn lọc tế bào mang gen chuyển và tạo cây chuyển gen từ các tế bào này. Thử nghiệm với các gen mã hóa cho neomycin phosphotransferase (nptII) và beta- glucuronidase (uidA) và nuôi trong môi trường chọn lọc sau đó phân tích phân tử, nghiên cứu đã chỉ ra rằng, DNA ngoại lai có thể tồn tại trong hệ gen của sắn một cách bền vững và lâu dài [56].
Hình 4 mơ tả 4 hệ thống hiện đang sử dụng để chuyển gen vào sắn [59]. Bốn hệ thống này sử dụng 4 loại mơ đích khác nhau làm đối tượng chuyển gen: Mô lá chưa trưởng thành, các cấu trúc phơi, mảnh lá mầm, và mơ sẹo phơi hóa. Mơ lá chưa trưởng thành và các cấu trúc phôi chỉ có thể chuyển gen thơng qua vi khuẩn A. tumefaciens
trong khi đó mảnh lá mầm hay mơ sẹo phơi hóa có thể sử dụng thêm súng bắn gen để chuyển gen. Sau khi chuyển gen, mơ đích được tái sinh trên mơi trường chọn lọc để tạo cây hoàn chỉnh mang gen cần chuyển. Các đánh giá phân tích cả 4 hệ thống chuyển gen cho thấy mỗi hệ thống trên đều có những ưu, nhược điểm riêng. Mặc dù vậy, các nhà khoa học thường ưu tiên lựa chọn phương pháp chuyển gen sử dụng A. tumefaciens thay vì súng bắn gen vì lí do sử dụng A. tumefaciens có chi phí thấp hơn
và cho kết quả ổn định hơn. Khoảng 50% số cây chuyển gen thu được thông qua A. tumefaciens chỉ mang 1 bản gen cần chuyển trong khi con số này chỉ là 10% khi sử
dụng súng bắn gen.
Năm 2009, Bull và cộng sự phát triển phương pháp cải tiến kết hợp sử dụng A.
Tumefaciens để chuyển gen vào phơi mơ sẹo phơi hóa cho tần suất biến nạp và tái sinh cây chuyển gen cao hơn hẳn các phương pháp cũ. Cho đến nay, phương pháp này vẫn là phương pháp được sử dụng phổ biến để chuyển gen mong muốn vào cây sắn [18].
Cũng như chọn tạo giống ở các cây trồng khác, một trong các vấn đề quan trọng đối với chọn giống sắn là làm sao tích hợp được gen đích mong muốn vào một nguồn gen phù hợp. Đây cũng là một khó khăn với cơng tác tạo giống sắn bằng phương pháp chuyển gen vì lý do các giống sắn phản ứng khác nhau trong điều kiện nuôi cấy in vitro, đặc biệt là trong q trình tạo mơ đích phục vụ biến nạp. Do đó, việc nghiên cứu
khả năng tái sinh và tạo mơ đích phục vụ biến nạp là cần thiết trên các giống sắn triển vọng [41].
Một vài thành công của sắn chuyển gen bao gồm nhiều giống sắn mới với các đặc tính khác nhau như: giảm hàm lượng cyanua [57], kháng sâu [34], tỉ lệ amylose thấp [33], kháng thuốc trừ cỏ [54]. Mặc dù chưa có cơng bố quốc tế về chuyển gen ở sắn tạo giống tăng năng suất và có khả năng kháng bệnh, nhưng chuyển gen ở các đối tượng cây trồng khác cho thấy tiềm năng tạo ra các giống sắn có năng suất và khả năng kháng bệnh cao bằng kĩ thuật biến nạp gen.
Tại Việt Nam, việc nghiên cứu mơ sẹo phơi hóa ở sắn vẫn cịn khá hiếm. Các nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở việc tạo mô sẹo và các cấu trúc phôi từ thân và từ các mảnh lá non. Hơn nữa, việc tạo thành cơng mơ sẹo phơi hóa cho các giống sắn được trồng tại Việt Nam cho đến nay vẫn chưa được cơng bố. Vì vậy, vấn đề nghiên cứu sự tạo mơ sẹo phơi hóa cho giống mơ hình TMS 60444 sẽ là tiền đề cho việc nghiên cứu tạo mơ sẹo phơi hóa cho các giống sắn Việt Nam.