CHƢƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp khử trùng tạo mẫu sạch
Cắt những đoạn thân non dài 1,5 – 2 cm và có chứa chồi nách, rửa bằng xà phòng dưới vòi nước chảy để loại bớt các vi sinh vật trên bề mặt thân. Cho các đoạn thân vào bình tam giác và tiến hành khử trùng trong box cấy vô trùng.
Đầu tiên rửa đoạn thân bằng nước cất vơ trùng. Sau đó khử trùng bề mặt của đoạn thân bằng cồn 70% trong vịng 30 giây và rửa sạch bằng nước cất vơ trùng từ 3 - 5 lần. Tiếp theo khử trùng bằng Javen (NaClO) ở nồng độ thí nghiệm là 0,5%, 0,7% và 1% trong khoảng thời gian 15 phút. Rửa lại bằng nước cất vô trùng rồi dùng que cấy vô trùng lấy các đoạn thân cấy vào môi trường MS
Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, mỗi lần 5 bình tam giác, mỗi bình cấy 5 đoạn thân dài khoảng 1,5-2 cm và có chứa mắt chồi.
2.2.2. Phương pháp nhân giống trong ống nghiệm
- Tạo cụm chồi:Cây sắn hoàn chỉnh được loại bỏ hết lá, sau đó cắt thành các
đoạn từ 2-3 cm, mỗi đoạn cắt gồm một đến hai mắt chồi, vị trí cắt ở phía trên mắt chồi cách mắt chồi 0,2-0,5 cm. Các đoạn cắt được cấy trong mơi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) có bổ sung 3 mg/l BAP với điều kiện chiếu sáng 16h/ ngày ở 28°C.
- Chỉ tiêu theo dõi : dựa vào hệ số tạo cụm chồi của mỗi giống sau 4 tuần ni cấy được tính theo cơng thức sau:
- Nhân cụm chồi: Tách các chồi đơn từ cụm chồi và cấy vào môi trường MS +
1mg/l BAP + 20g/l đường với điều kiện chiếu sáng 16h/ ngày ở 280 C. Tính theo cơng thức tương tự công thức của hệ số tạo cụm chồi sau 3 tuần nuôi cấy.
- Kéo dài cụm chồi: Chuyển cụm chồi của các giống đã được hình thành ở các
thí nghiệm trên vào mơi trường MS cơ bản (Murashige & Skoog, 1962) có bổ sung 0,2mg/l GA3, khơng agar với điều kiện chiếu sáng 16h/ ngày ở 28°C. Tính hệ số kéo dài chồi của các giống nghiên cứu sau 4 tuần nuôi cấy theo công thức sau:
2.2.3. Nghiên cứu khả năng tạo mơ sẹo phơi hóa
Các cây sắn cao khoảng 8cm được loại bỏ hết lá và cắt thành các đoạn dài 1,5-2 cm và có chứa mắt chồi và đưa vào mơi trường CAM chứa BAP 10mg/l để kích thích tạo chồi. Sau 2-4 ngày tách chồi nách và chuyển đến mơi trường CIM có chứa picloram 12 mg/l để cảm ứng tạo mô sẹo. Khối mô sẹo 2 – 4 tuần tuổi được loại bỏ dịch nhày, tách nhỏ, và chuyển đến mơi trường DKW có chứa picloram 12 mg/l để
chọn lọc các khối mô sẹo chất lượng. Tiếp tục lựa chọn các khối mô sẹo chất lượng và chuyển sang mơi trường MMS có chứa picloram 12 mg/l để tăng sinh khối mơ sẹo và tạo mơ sẹo phơi hóa. Mơ sẹo phơi hóa được tạo thành sẽ được lựa chọn và chuyển sang môi trường MMS mới chứa picloram 12 mg/l để tăng sinh khối. Các bước tiến hành thí nghiệm được tóm tắt qua bảng sau:
Bảng 4: Khái quát các bƣớc tạo mơ sẹo phơi hóa ở sắn
Stt Giai đoạn Mơi
trƣờng
Hormone Thời
gian
Chu kì sáng:tối (nhiệt độ)
1 Tạo vật liệu khởi đầu MS - 4-8 tuần 16h:8h (28°C) 2 Tạo chồi nách CAM BAP 10mg/L 2-4 ngày 0h:24h (28°C) 3 Tạo mô sẹo CIM Picloram
12mg/L
2 - 4 tuần
0h:24h (28°C)
4 Tạo mơ sẹo phơi hóa DKW Picloram 12mg/L
2 - 4 tuần
0h:24h (28°C)
5 Tạo và nhân mơ sẹo phơi hóa 1/10MS (MMS) Picloram 12mg/L 4 – 10 tuần 0h:24h (28°C)
Sự lựa chọn cấu trúc mô sẹo chất lượng và các cụm mơ sẹo phơi hóa được thực hiện dưới kính hiển vi soi nổi Leica (Đức) với độ phóng đại 6 lần.
Sự hình thành mơ sẹo phơi hóa được đánh giá dựa vào thời gian tạo mô sẹo, sự gia tăng sinh khối mô sẹo trong các môi trường nuôi cấy, độ nhày của khối mơ sẹo, màu sắc mơ sẹo, tính đồng nhất của quần thể tế bào trong mô sẹo.
Tỷ lệ tạo mơ sẹo được tính bằng số cụm mơ sẹo trên số chồi ban đầu.
Tỷ lệ tạo mơ sẹo phơi hóa được tính bằng số cụm mơ sẹo phơi hóa trên số chồi ban đầu.
2.2.4. Nghiên cứu khả năng tái sinh thành cây hồn chỉnh từ mơ sẹo phơi hóa
Mơ sẹo phơi hóa được hình thành ở môi trường MMS bổ sung picloram 12mg/l sẽ được chuyển sang môi trường MSN chứa NAA 1mg/l. Nuôi ở 28°C với điều kiện chiếu sáng 16h/ngày trong 8 tuần, chu kì cấy chuyển 2 tuần/lần.Sau 8 tuần trong môi trường MSN lại tiếp tục cấy chuyển mơ sẹo phơi hóa sang mơi trường CEM chứa BAP 0,4mg/l. Nuôi ở 28°C trong 4-8 tuần, 2 tuần cấy chuyển 1 lần. Sau khi mô sẹo phơi hóa tạo được chồi và rễ thì sẽ chuyển cây tái sinh đến mơi trường MS cơ bản để phát triển thành cây hoàn chỉnh.
2.2.5. Phương pháp biến nạp
2.2.5.1. Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào mơ sẹo phơi hóa a. Chuẩn bị dung dịch khuẩn cho biến nạp
A. tumefaciens mang plasmid có các gen cần chuyển đã được chuẩn bị
sẵn. Nuôi một khuẩn lạc vi khuẩn A.tumefaciens mang plasmid cần chuyển trong 10ml mơi trường YEB (lỏng) có bổ sung 25mg/l rifampicin, 50mg/l streptomycin, 50mg/l spectomycin, 50mg/l gentamycin và glycerol 2% ni lắc 100 vịng/phút ở 280C trong thời gian 48 giờ (OD600 = 0,7 - 1).
Ly tâm A.tumefaciens với tốc độ 4000 vòng/phút trong 10 phút để thu cặn A.tumefaciens rồi hịa cặn trong MMS lỏng có chứa acetosyringone 200µM và đo OD
của dung dịch pha loãng ở các giá trị OD600 = 0,25, OD600 = 0,5 và OD600 = 0,7. Các dung dịch có OD600 này sẽ được sử dụng để ngâm mơ sẹo phơi hóa.
b. Qui trình biến nạp
Các cụm mơ sẹo phơi hóa từ 14-20 ngày tuổi có màu vàng tươi và tơi xốp được chọn và tách ra để sử dụng cho thí nghiệm biến nạp
Đổ dịch vi khuẩn đã chuẩn bị vào ống fancol 50ml có chứa mơ sẹo phơi hóa , sau đó để trên máy lắc ở nhiệt độ phòng, khoảng 5 phút. Loại bỏ dung dịch, thấm khơ mơ sẹo phơi hóa bằng giấy lọc tuyệt trùng. Sau đó, chuyển mơ sẹo phơi hóa sang mơi trường đồng ni cấy (mơi trường MMS có bổ sung AS (acetosyringone) 200µM) trong 4 ngày ở điều kiện chiếu sáng 16h/ ngày và nhiệt độ 280C.
c. Loại bỏ vi khuẩn sau biến nạp
Khối mô sẹo được biến nạp sau 4 ngày đồng nuôi cấy tiến hành rửa mô phôi để loại bỏ vi khuẩn. Rửa mô bằng dung dịch MMS đã khử trùng có bổ sung kháng sinh Cefotaxime để diệt khuẩn. Sau đó, thấm khơ mơ phơi bằng giấy thấm tiệt trùng và chuyển chúng sang môi trường nhân mơ sẹo (MMS) có bổ sung Cefotaxime ở các nồng độ từ 0, 300, 400, 500, 600, 700 mg/l. Sau một tuần thấy mơ sẹo phơi hóa khơng
bị nhiễm khuẩn trở lại thì cấy chuyển sang mơi trường MMS khơng có kháng sinh và tiếp tục nuôi cấy trong 2 – 3 tuần nữa.
Xác định nồng độ Cefotaxime thích hợp để chọn lọc mơ sẹo phơi hóa sau biến nạp thơng qua tỉ lệ cụm mơ sẹo phơi hóa sống sót mà khơng bị nhiễm khuẩn và đặc điểm mơ sẹo phơi hóa trong mơi trường tái sinh có bổ sung các dải nồng độ Cefotaxime khác nhau
Sử dụng công thức xác định tỷ lệ số cụm mơ sẹo phơi hóa sống sót và khơng bị nhiễm sau biến nạp theo công thức sau :
(Số cụm mơ sẹo phơi hóa sống sót, khơng bị nhiễm sau biến nạp/ số cụm mơ sẹo phơi hóa ban đầu)x 100%
2.2.5.2. Nghiên cứu khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh từ mơ sẹo phơi hóa sau biến nạp và chọn lọc cây chuyển gen
Các mơ sống sót sau 3 - 4 tuần ni cấy tại MMS được chuyển sang môi trường tái sinh cây (MSN) ở nhiệt độ 280C thời gian chiếu sáng 16h/ ngày đêm và cường độ chiếu sáng 2000 lux. Sau 8 tuần, các cụm chồi thật xuất hiện từ các cụm mơ sẹo phơi hóa sẽ được tách ra và cấy chuyển sang môi trường tạo rễ (CEM) có bổ sung 3mg/l glufosinate để tiếp tục chọn lọc. Sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường tạo rễ, các cây tái sinh được sử dụng làm nguyên liệu để tách chiết ADN.
Tỷ lệ cây tái sinh mang gen = (Số cây sống sót biểu hiện gen GFP/ Tổng số cụm mơ sẹo phơi hóa ban đầu) x 100%