3.1. Nghiên cứu tạo mẫu sạch
Khử trùng mẫu là cơng đoạn đầu tiên có ý nghĩa quyết định đến kết quả của quá trình ni cấy mơ và tế bào thực vật [4], [7], [13]. Với những đoạn thân non của sắn đã được lựa chọn để khử trùng như mô tả ở mục 2.2.1., sau 14 ngày quan sát thu được kết quả sau:
Hình 5: Tỷ lệ mẫu sống của các giống sắn nghiên cứu ở các nồng độ NaClO khác nhau
Kết quả thí nghiệm cho thấy, ở nồng độ chất khử trùng càng cao thì mẫu thu được càng sạch, tuy nhiên, lượng mẫu sống giảm dần. Do đó, cần lựa chọn nồng độ chất khử trùng phù hợp để thu được hiệu quả khử trùng cao nhất, được đánh giá theo tỷ lệ mẫu sống và mẫu sạch thu được. Với các nồng độ NaClO được thử nghiệm, nồng độ 0,5% cho mẫu sống cao nhất ở tất cả các giống nghiên cứu, tuy nhiên, ở nồng độ này chưa thích hợp nhất để đạt tỷ lệ mẫu sạch lớn nhất. Thay vì thế, nồng độ NaClO khoảng 0,7% là phù hợp nhất với mục tiêu nghiên cứu khi cho tỷ lệ mẫu sống chênh
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 HL2004-28 KM140 KM419 TMS60444 Average of 0,5 Average of 0,7 Average of 1,0 Nồng độ NaClO 0,5% Nồng độ NaClO 0,7% Nồng độ NaClO 1,0%
lệch không đáng kể (từ 5-10%, trung bình 7,3%) so với nồng độ NaClO = 0,5% nhưng tỷ lệ mẫu sạch lại cao hơn hẳn so với các nồng độ cịn lại (từ 5-20%, trung bình 14%).
Ngược lại với tỷ lệ trên, tỷ lệ mẫu sống khi xử lý bằng NaClO nồng độ 0,7% cao hơn đáng kể so với nồng độ NaClO 1% (từ 10-36%, trung bình 20%) trong khi độ chênh lệch về tỷ lệ sạch lại không đáng kể (từ 0,4-15%, trung bình 0,5%). Như vậy, sử dụng NaClO nồng độ 0,7% đạt ưu thế lớn về tỷ lệ cây sống cao hơn so với nồng độ 1%. Kết quả phân tích có ý nghĩa thống kê với α =0,05.
Hình 6: Tỷ lệ mẫu sạch của các giống sắn nghiên cứu ở các nồng độ NaClO khác nhau
Điều kiện dung dịch NaClO với nồng độ 0,7% trong thời gian 15 phút đạt hiệu quả khử trùng cao nhất ở tất cả các giống. Như vậy để kết quả khử trùng mẫu đạt hiệu quả cao nhất thì việc lựa chọn nồng độ NaClO là rất quan trọng. Trong thí nghiệm này, mẫu thân non cây sắn được xử lí với dung dịch NaClO 0,7% trong thời gian 15 phút được cho là phù hợp nhất. Với các giống sắn nghiên cứu nêu trên, giống có khả năng chống chịu tốt nhất với NaClO là giống TMS 60444, tiếp theo là giống KM 140. Giống HL 2004-28 chống chịu thấp nhất khi được xử lí bằng dung dịch NaClO.
Vi khuẩn và nấm là hai nguồn gây nhiễm trong nuôi cấy mô thực vật. Bào tử nấm rất nhỏ nhẹ và hiện diện khắp nơi trong môi trường sống. Khi bào tử nấm tiếp xúc với môi trường ni cấy sẽ nảy mầm và nhanh chóng phát triển thành nguồn gây nhiễm [7].Khử trùng mẫu cấy khó thực hiện vì mẫu thực vật để ni cấy khơng thể khử trùng bằng nhiệt độ cao, mà phải khử trùng để cho mẫu vô trùng nhưng vẫn đảm bảo được
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 HL2004-28 KM140 KM419 TMS60444 Average of 0,5% Average of 0,7% Average of 1,0% Nồng độ NaClO 0,5% Nồng độ NaClO 0,7% Nồng độ NaClO 1,0%
bản chất sinh học của mẫu. Do vậy, các mẫu cấy (mô, cơ quan) thực vật phải được khử trùng bằng các hóa chất. Các hóa chất dùng để khử trùng phải tiêu diệt hoàn toàn các tác nhân gây nhiễm nhưng vẫn duy trì sức sống của các mẫu ni cấy [61].Hiệu quả khử trùng phụ thuộc vào loại hóa chất sử dụng, thời gian và nồng độ của các hóa chất khử trùng.
Trong thí nghiệm này, chất khử trùng được lựa chọn là NaClO với mục đích khử trùng bề mặt mẫu ni cấy, có tác dụng chủ yếu là diệt khuẩn và diệt vi nấm kí sinh trên bề mặt mẫu ni. Thơng thường, có một số chất khác cũng có tác dụng khử trùng mẫu mơ thực vậtnhư hypoclorit canxi – Ca(ClO)2, thủy ngân clorua (HgCl2), oxy già (H2O2) [38], [51]. Trong khi hypoclorit canxi được đánh giá là kém hiệu quả hơn natri hypoclorit và thường thường chứa các tạp chất ít tan thì oxy già lại phù hợp hơn đối với khử trùng các mẫu có nguồn gốc động vật. Một chất hoạt động bề mặt khác cũng được sử dụng trong trong nuôi cấy mô thực vật là HgCl2, tuy nhiên, chất này vô cùng độc hại đối với cả người và thực vật. Trong khi đó, sử dụng NaClO với nồng độ thấp để khử trùng mẫu thân non của cây sắn là phù hợp vì tính phổ biến của hóa chất và hiệu quả khử trùng rất cao [46]. Chính vì thế, đây là hóa chất thường được sử dụng nhiều nhất trong ni cấy mô thực vật.
Với 4 giống sắn được thử nghiệm, giống TMS 60444 có khả năng chống chịu với chất khử trùng mạnh nhất, thể hiện ở tỷ lệ mẫu sống và mẫu sạch (tương ứng là 86% và 88%), cao hơn hẳn so với các giống còn lại khi tỷ lệ các giống này chỉ dao động từ 73-78% mẫu sống, và 67-79% mẫu sạch. Kết quả phân tích có độ tin cậy 95%. Giống TMS 60444 đạt tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu sạch vi sinh vật cao nhất vì đây là giống sắn có nguồn gốc từ châu Phi, nơi mà có điều kiện khí hậu rất khắc nghiệt. Do đó, khả năng chống chịu và thích nghi với điều kiện sống sẽ cao hơn so với các giống sắn có nguồn gốc Việt Nam. Đối với các giống sắn Việt Nam, giống KM 140 mang nhiều ưu điểm hơn cả 2 giống sắn cịn lại. Vì vậy mà sức sống và khả năng chống chịu khi xử lí với dung dịch NaClO cũng cao hơn hẳn 2 giống KM 419 và HL 2004-28.
3.2. Nghiên cứu thí nghiệm tạo chồi, nhân cụm chồi và kéo dài chồi
Nguồn vật liệu ban đầu sử dụng để tạo mơ sẹo phơi hóa rất quan trọng. Để tạo ra được lượng lớn mơ sẹo phơi hóa, phục vụ cho cơng tác chuyển gen thì cần tạo ra lượng lớn cây sắn in vitro. Số lượng cây mới được đánh giá thông qua lượng chồi tạo được trong quá trình sinh trưởng và biệt hóa của mơ. Hiệu quả tạo chồi được đánh giá thông qua các hệ số tạo cụm chồi, hệ số nhân cụm chồi và hệ số kéo dài cụm chồi, các yếu tố rất quan trọng, đặc trưng cho khả năng tăng nhanh lượng chồitrong các môi trường nhân nhanh, cũng là các yếu tố quyết định đến cách bố trí và thời gian thực hiện thí nghiệm. Hệ số tạo cụm chồi, hệ số nhân cụm chồi và hệ số kéo dài cụm chồi của các giống sắn nghiên cứu được thể hiện trong bảng sau (Bảng 5).
Bảng 5. Hệ số của các thí nghiệm tạo cụm chồi, thí nghiệm nhân cụm chồi và thí nghiệm kéo dài chồi
STT Tên giống Hệ số tạo
cụm chồi
Hệ số nhân
cụm chồi Hệ số kéo dài chồi
1 HL 2004-28 4.28± 0.12 3.95± 0.12 6.68± 0.15 2 KM 140 3.96± 0.09 3.61± 0.18 7.05± 0.13 3 KM 419 4.05± 0.07 3.84± 0.16 7.03± 0.09 4 TMS 60444 3.68± 0.13 3.37± 0.22 5.12± 0.35
Nghiên cứu thí nghiệm tạo cụm chồi sử dụng mơi trường MS cơ bản có bổ sung BAP với nồng độ 3mg/l cho thấy các giống sắn đều có biểu hiện tốt với hệ số tạo cụm chồi khá đồng đều. Trong đó, giống HL 2004-28 đạt được hệ số tạo cụm chồi cao nhất là 4,28 còn giống TMS 60444 đạt hệ số tạo cụm chồi thấp nhất là 3,68.
Các giống sắn đều có biểu hiện thích ứng tốt trong mơi trường nhân nhanh. Trong môi trường MS cơ bản bổ sung 1mg/l BAP, giống HL 2004-28 thể hiện khả năng nhân nhanh tốt nhất, với hệ số nhân cụm chồi đạt 3,95, cao nhất trong các giống sắn nghiên cứu, trong khi giống TMS 60444 đạt hệ số nhân cụm chồi là 3,37, thấp nhất trong các giống.
Nghiên cứu thí nghiệm kéo dài cụm chồi sử dụng môi trường MS cơ bản, khơng có agar và bổ sung 0,2mg/l GA3 cho thấy khả năng kéo dài chồi của các giống sắn nghiên cứu là khá đồng đều. Hai giống KM 140 và KM 419 có hệ số kéo dài chồi khá cao. Hệ số kéo dài chồi của KM 140 là 7,05 còn hệ số kéo dài chồi của KM 419 là 7,03. Giống TMS 60444 có hệ số kéo dài chồi thấp nhất là 5,12.
Như vậy, các giống sắn nghiên cứu là HL 2004-28, KM 140, KM 419, TMS 60444 đều thích ứng với nồng độ chất kích thích sinh trưởng được thử nghiệm. Trong cùng điều kiện môi trường nhân nhanh, các giống sắn có kiểu gen khác nhau có phản ứng khơng giống nhau, trong đó, giống TMS 60444 có nguồn gốc châu Phi phát triển kém ưu thế hơn so với 3 giống sắn có nguồn gốc Việt Nam, tuy sự chênh lệnh này không đáng kể so với các giống cịn lại với mức ý nghĩa α=0,05. Kết quả thí nghiệm cũng cho thấy, môi trường MS cơ bản có bổ sung các chất kích thích sinh trưởng BAPvới nồng độ 1mg/l và GA3 0,2mg/l phù hợp để tạo ra được số lượng lớn cây sắn
in vitro không bị nhiễm vi sinh vật phục vụ cơng tác tạo mơ sẹo phơi hóa.
Hình 7. Kết quả thí nghiệm tạo cụm chồi của giống HL 2004-28 sau 28 ngày nuôi cấy
3.3. Nghiên cứu tạo mơ sẹo phơi hóa từ chồi nách cây sắn a. Xác định khả năng tạo mô sẹo của các giống sắn nghiên cứu
Nghiên cứu sử dụng 300 chồi nách của mỗi giống sắn nghiên cứu, sau 2 tuần nuôi cấy trong mơi trường CIM thì tỉ lệ tạo mơ sẹo của các giống sắn nghiên cứu đạt được lần lượt như sau: 96,3% đối với giống TMS 60444; 88,7% đối với giống KM 140; 81,3% đối với giống KM 419 và 77,7% đối với giống HL 2004-28 (bảng 6).
Bảng 6. Nghiên cứu tạo mô sẹo từ chồi nách trên môi trƣờng CIM
Tên giống Lần thí nghiệm Tổng số chồi nách ni cấy Số chồi tạo mô sẹo Tỷ lệ tạo mô sẹo (%) Tỷ lệ tạo mơ sẹo trung bình (%) TMS 60444 1 100 95 95 96,3 2 100 97 97 3 100 97 97 KM 140 1 100 86 86 88,7 2 100 93 93 3 100 87 87 KM 419 1 100 83 83 81,3 2 100 79 79 3 100 82 82 HL 2004-28 1 100 77 77 77,7 2 100 80 80 3 100 76 76
Như vậy, khi nuôi cấy chồi nách trong thời gian 2 tuần tại mơi trường CIM có chứa picloram 12mg/l thì nhận thấy cả bốn giống sắn nghiên cứu đều cảm ứng tạo mô sẹo. Tuy nhiên trong số các giống nêu trên thì giống TMS 60444 là giống đạt tỉ lệ tạo mơ sẹo cao nhất. Trong 3 giống có nguồn gốc Việt Nam thì giống KM 140 là giống sắn có tiềm năng nhất vì giống sắn này đạt tỷ lệ mơ sẹo cao hơn 2 giống cịn lại. Giống HL 2004-28 có tỷ lệ đạt mơ sẹo thấp nhất.
Hầu hết các mô hay cơ quan thực vật đều có thể sử dụng để ni cấy cho việc tạo mô sẹo, tuy nhiên mức độ thành công lại phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau.
Ngồi điều kiện mơi trường ni cấy thì giống thực vật là một trong các yếu tố quan trọng quyết định đến sự tăng trưởng và phát sinh hình thái của tế bào và mơ thực vật. Bộ phận được sử dụng làm nguyên liệu nuôi cấy mô cũng là yếu tố quyết định hiệu quả của q trình ni cấy. Về lý thuyết,bất kỳ bộ phận nào thu được từ bất kỳ loài thực vật nào cũng có thể được sử dụng để tạo ra các mô sẹo, tuy nhiên mức độ thành cơng của q trình tạo mơ sẹo phụ thuộc vào tính chất đặc trưng của chúng. Thân cây, lá, rễ, hoa, hạt giống và các bộ phận khác của cây đều có thể được sử dụng, tuy nhiên những bộ phận cây non thường được sử dụng và cho hiệu quả cao nhất. Trong nghiên cứu này, chồi nách từ thân cây sắn in vitro được nuôi cấy để nghiên cứu khả năng tạo mơ sẹo phơi hóa của các giống sắn bởi khả năng sinh trưởng nhanh hơn hẳn so với các bộ phận khác trong q trình ni cấy mơ.
Mô sẹo của các giống nghiên cứu trông khá tương tự nhau khi ở giai đoạn 2 tuần tuổi trong môi trường CIM. Tất cả các cụm mô sẹo tạo thành từ chồi nách đều có màu vàng nhạt và độ nhày cao. Các khối mơ sẹo bắt đầu có sự phân hóa thành các hình dạng mơ phơi khác nhau (Xem hình 8).
Hình 8. Các cụm mơ sẹo 2 tuần tuổi trong môi trường CIM
Sau khi mơ sẹo được hình thành từ chồi ở mơi trường CIM trong 2 tuần tuổi thì mơ sẹo sẽ được loại bỏ hết các dịch nhầy và được chuyển đến môi trường DKW, nuôi mô sẹo trong môi trường DKW sau thời gian 2 tuần nhận thấy các khối mô sẹo của các giống sắn nghiên cứu có sự thay đổi về màu sắc, hình dạng, kích thước. Mơ sẹo các giống đều vàng hơn sau 2 tuần nuôi cấy. Khối mô sẹo của giống TMS 60444 là có màu vàng tươi, khối mô sẹo của các giống HL 2004-28 và KM 419 có màu vàng nhạt, khối mơ sẹo của giống KM 140 có màu vàng đậm hơn các khối mơ sẹo của các giống sắn khác (Hình 9). Về kích thước, giống TMS 60444 có hệ số gia tăng kích thước cao nhất đạt được là 2, sự gia tăng kích thước của giống KM 140 và KM 419 là tương đương nhau, giống HL 2004-28 có sự gia tăng kích thước thấp nhất. Về độ nhày, giống TMS 60444 và KM 140 có độ nhày thấp nhất, giống KM 419 và HL 2004-28 có độ nhày cao và chiếm đến 50%-60% kích thước của tồn bộ khối mơ sẹo (Bảng 7).
Bảng 7. Đánh giá chất lƣợng mô sẹo sau 2 tuần nuôi cấy trong môi trƣờng DKW
STT Tên giống Màu sắc mơ sẹo Hệ số gia tăng kích thƣớc Độ nhày(%)
1 HL 2004-28 Vàng nhạt 1,3 60%
2 KM 140 Vàng đậm 1,6 20%
3 KM 419 Vàng nhạt 1,5 50%
- Hệ số gia tăng kích thước được tính bằng tỷ lệ giữa kích thước khối mơ sẹo hiện tại và kích thước khối mơ sẹo ban đầu
- Độ nhày được tính bằng tỷ lệ giữa kích thước khối nhày và kích thước tồn bộ khối mơ sẹo
Các khối mơ sẹo đều có khả năng phát sinh các dạng phôi khác nhau. Tuy nhiên ở mỗi giống sắn khác nhau thì các dạng phơi thế hệ tạo ra với số lượng và hình dạng khác nhau. Ở giai đoạn 28 ngày tuổi tại môi trường DKW, khối mô sẹo của giống TMS 60444 phát sinh dạng phơi hình cầu với tỷ lệ nhiều nhất, tiếp đến là giống KM 140,giống sắn KM 419 có tỷ lệ phơi hình thuỷ lơi lớn nhất, giống HL 2004-28 có tỷ lệ phơi dạng lá mầm là lớn nhất.
Bảng 8: Đánh giá tỷ lệ mô sẹo phát sinh phôi ở giai đoạn 28 ngày tuổi tại môi trƣờng DKW
Giống sắn Tỷ lệ mô sẹo
phát sinh phôi (%) Tỷ lệ phơi hình cầu (%) Tỷ lệ phơi hình thủy lơi (%) Tỷ lệ phơi hình lá mầm (%) TMS 60444 95,2 72,7 20,4 4,3 KM 140 80,6 53,1 30,2 10,7 KM 419 71,1 33,5 52,3 13,2 HL 2004-28 55,3 19,7 20,5 50,8
Hình 9. Khối mơ sẹo của các giống trong môi trường DKW sau 2 tuần nuôi cấy
Trong 4 giống được nghiên cứu thì giống TMS 60444 cho chất lượng mơ sẹo tốt nhất thể hiện ở các đặc điểm hình thái như khối mơ sẹo có màu vàng tươi, sự gia tăng sinh khối nhanh và độ nhày thấp. Chất lượng mô sẹo của giống HL 2004-28 xấu nhất vì khối mơ sẹo của giống này có sự gia tăng sinh khối chậm và độ nhày cao. Dựa vào các biểu hiện trên nên giống TMS 60444 sẽ được lựa chọn làm giống chuẩn để đánh giá chất lượng mơ sẹo của các giống cịn lại ở các giai đoạn môi trường tiếp theo. Với 3 giống nghiên cứu có nguồn gốc Việt Nam thì nhận thấy giống KM 140 ở giai đoạn môi trường DKW 2 tuần tuổi mang các đặc điểm hình thái tương đương với giống TMS 60444. Do đó, giống KM 140 được xác định là giống có tiềm năng tạo mơ sẹo phơi hóa.
b. Xác định khả năng tạo mơ sẹo phơi hóa của các giống sắn nghiên cứu