2.1. Đối tƣợng và vật liệu nghiên cứu
Hạt thầu dầu được cung cấp từ Viện Dược liệu và xác định tại Viện Hóa học – Mơi trường qn sự, Bộ Tư LệnhHóa học, Bộ Quốc Phịng và Phịng thí nghiệm Hóa sinh và Sinh lý học thực vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
Trong nghiên cứu này chúng tơi sử dụng 2 dịng tế bào HaCaT và SK-MEL 28. Dòng tế bào HaCaT và dòng tế bào SK-MEL28 được cung cấp từ hãng ATCC Hoa Kỳ.
Chúng tôi sử dụng 3 chủng vi khuẩn E.coli (ATCC® 25922™),
Staphylococcus aureus (ATCC® 25923™), Bacilus cereus (ATCC® 14579™), được cung cấp từ hãng ATCC Hoa Kỳ; và chủng vi khuẩnVibrio vulnificus được phân lập từ tôm mắc bệnh hoại tử gan tụy tại Viện Ni trồng thủy sản TW.
2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu
Hóa chất:
- Màng thẩm tích xelophan (ICN Biomedical) - Gel Sephadex G-100 (Amersham Biosciences) - DEAE Xenlulo (Armesham)
- Ricin chuẩn (chuỗi A và chuỗi B) (Vectorlabs, Hoa Kỳ)
- Hóa chất ni cấy tế bào: Môi trường RPMI, FBS, Kháng sinh Penicilin, PBS 1x (ATCC).
- Kháng thể ERK, p-ERK, HPR (ATCC, Hoa Kỳ).
- Cùng một số hóa chất khác được mua từ những hãng nổi tiếng như Sigma, ATCC….đạt chuẩn trong nghiên cứu sinh học phân tử. Dụng cụ và vật tư tiêu hao
- Buồng đếm tế bào (Malassez, Pháp) - Đĩa nuôi cấy đa giếng (SPL, Hàn Quốc)
- Đĩa nuôi cấy tế bào 100mm (Corning, Hoa Kỳ) - Ống eppendorf 1,5 ml (Corning, Hoa Kỳ)
- Ống falcon 15, 50 ml (Corning, Hoa Kỳ)
- Đầu típ 100µl, 200µl, 1000µl (SPL, Hàn Quốc) Máy móc và trang thiết bị chính:
- Bể ổn nhiệt Gra Operation SS40-1 (Đức)
- Hệ thống phân tích dịng tế bào miễn dịch tự động - Huỳnh quang kế
- Kính hiển vi soi ngược Axiovert 40 CFL (Carl Zeiss, Đức) - Máy Elisa
- Máy lắc ổn nhiệt (Satorius, Đức) - Máy li tâm Universal (Hettich, Đức) - Máy ly tâm lạnh (Eppendorf, Đức) - Máy soi gel Gel Doc (Biorad, Hoa Kỳ) - Thẩm tách miễn dịch (Biorad, Hoa Kỳ) - Thiết bị điện di đứng (Biorad, Hoa Kỳ) - Tủ ấm 5% CO2
- Tủ ấm nuôi vi khuẩn
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp tách dịch chiết thô từ hạt thầu dầu
Bước đầu của nghiên cứu, thí nghiệm xác định thử hoạt tính kháng khuẩn của ricin được thực hiện nhằm định tính hoạt tính của hạt thầu dầu thu đã thu được.
Nghiên cứu được tiến hành như sau: Lựa chọn hạt thầu dầu bóng khỏe, rửa sạch 2 lần với nước cất, để ráo. Hạt thầu dầu được nghiền nhỏ, bổ sung nước khử ion theo tỉ lệ 1:10 (m/v), sau đó nghiền siêu âm 35 kHz trong 5 phút trên đá lạnh. Đem mẫu ly tâm 3000 vòng/5 phút, loại bỏ cặn, thu dịch nổi và bảo quản tại điều kiện -20oC.
2.3.2. Phương pháp tách chiết protein tổng số
Thu dịch chiết từ hạt thầu dầu:
Hạt thầu dầu được lựa chọn và rửa sạch bằng nước cất 2 lần, sau đó được nghiềndưới áp suất cao để loại bỏ dầu và thu bã. Bã thầu dầu được sấy khôtrong tủ
sấy 40oC và bổ sung axit acetic 5% theo tỉ lệ 1:10 (100g/1000ml), ủ lắc 12 giờ tại nhiệt độ phòng với tốc độ 400 vòng/phút.Sau 12 giờ, thu dịch và lọc dịchqua màng lọc. Dịch chiết đã lọc được cất quaybằng máy cô quay chân không tại điều kiện 40oC – 45oC.
Tủa protein tổng số:
Chia dịch cất quay đã thu được vào các ống nhỏ, bổ sung từ từ dung dịch muối amoni sunfat tỉ lệ 30%, 40%, 50%, 60% và 70% vào các ống. Đồng thời khuấy nhẹ cho muối tan hết ở 4oC. Ủ hỗn hợp trong 4oC trong vòng 3 tiếng để tủa hết protein.Ly tâm dung dịch trong 12000 vịng/ phút trong 30 phút, sau đó loại bỏ dịch nổi, thu tủa và bổ sung đệm hòa tan protein.
2.3.3. Phương pháp tách chiết và tinh sạch Ricin
2.3.3.1. Phương pháp tinh sạch ricin bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion DEAE – sepharose
Chúng tôi tiến hành phân tách protein tổng số thu được sau bước tủa với (NH4)SO4 bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion DEAE – sepharose (được cung cấp bởi Amersham Biosciences).
Thí nghiệm được thực hiện qua các bước sau:DEAE được ngâm trong dung dịch đệm Tris – HCl 0,05M pH 8 qua đêm. Sau đó trộn 20ml dung dịch protein tổng số với 50 ml DEAE gel, khuấy 15 phút để proteinhấp phụ vào trong gel.Tải gel đã gắn protein thu được lên cột thủy tinh có kích thước 1,5 cmx 40 cm. Tiến hành rửa cột với 100ml đệm Tris – HCl 0,05M và để cố định 30 phút. Cột được phản hấp phụ bằng dung dịch đệm Tris – HCl 0,05M tại pH 8 bổ sung NaCl 0,05M với vận tốc 20-30ml/giờ. Thu phân đoạn với thể tích 2ml/phân đoạn. Sau đó tiến hành kiểm tra nhanh sự có mặt của Ricin trong các phân đoạn bằng kit được cung cấp bởi Osborn, Hoa Kỳ.
2.3.3.2. Phương pháp tinh sạch ricin sử dụng sắc ký lọc gel sephadex G-100.
Sử dụng phương pháp sắc ký lọc gel sephadex G-100 để tiến hành phân tách và thu ricin từ các phân đoạn có mặt ricin.
Phương pháp được thực hiện như sau:Ngâm gel trong nước cất theo tỉ lệ 1g/10ml tại nhiệt độ phịng trong6 giờ. Sau đó tải gel lên cột thủy tinh có kích thước 2,5 cm x 50 cm và để ổn định trong 30 phút. Mẫu được tải lên cột và lọc chiết trong trong dung dịch đệm phosphat 0,002M tại pH 7,2. Tiến hành thu dịch lọc vớithể tích 2ml/phân đoạn.
2.3.3.3. Sử dụng phương pháp Bradford để định lượng nồng độ protein.
Phương pháp Bradford dựa vào liên kết giữa coomassie brilliant blue G-250 (CBB) với protein để tạo nên phức chất màu xanh, phức chất này có khả năng hấp thụ ánh sáng cực đại ở 595 nm. Phân tích cường độ màu có thể xác định được hàm lượng của protein trong dung dịch.
Sử dụng huyết thanh bò (BSA) với hàm lượng đã biết làm đường chuẩn. Cho 100µl dung dịch nổi thu được sau khi ly tâm vào ống nghiệm, bổ sung 500µl dung dịch Bradford, lắc đều và ủ trong 3 phút. Sau đó đem dung dịch thu được đo tại bước sóng 595nm bằng quang phổ kế. Giá trị A595 được so sánh với đường chuẩn để tính ra hàm lượng mẫu protein có trong mẫu.
2.3.3.4. Phương pháp thẩm tách miễn dịch
Phương pháp thẩm tách miễn dịch được thực hiện để kiểm tra độ tinh sạch của ricin thu được, chúng tôi tiến hành phương pháp thẩm tách miễn dịch với kháng thể ricin.
Phương pháp được thực hiện như sau: Dịch chiết tổng số được điện di trên gel SDS – PAGE.Sau đó lên chuyển màng nitrocellulose Hybond-P bằng phương pháp điện chuyển trong đệm Tris – Glycine chứa 10% Methanol trong 50phút. Trong q trình điện chuyển màng, vị trí các băng protein được giữ nguyên. Sau khi chuyển màng, ủ màng trong PBS 5% sữa gầy 60 phút tại nhiệt độ phòng.Đổ bỏ sữa gầy thừa và rửa sạch sữa gầy cịn sót lại với PBS pH 7,4 1x, bổ sung Tween 80 với tỉ lệ 0,1%. Màng sau đó được ủ với kháng thể sơ cấp (nghiên cứu sử dụng kháng thể đơn dòng ricin) tỉ lệ 1:2000 (v/v), lắc nhẹ 1 tiếng ở nhiệt độ phòng.Rửa màng 5 lần với PBS 1x bổ sung Tween 20 0,1% để loại bỏ kháng thể sơ cấp bám không đặc hiệu. Tiếp theo, ủ màng với kháng thể thứ cấp gắn HRPtỉ lệ 1:1000 trong bóng tối 1
giờ, tại nhiệt độ phịng. Sau đó, màng được rửa 5 lần với PBS 1x bổ sung Tween 20 0,1% để loại bỏ kháng thể thứ cấp bám không đặc hiệu.Các băng protein được phát hiện bằng dung dịch tráng phim và ghi nhận kết quả.
2.3.3.5. Phương pháp xác định độ tinh sạch của ricin
Sau khi lọc mẫu protein qua sắc ký lọc gel, để kiểm tra sự có mặt của ricin trong mỗi phân đoạn, 19 phân đoạn thu được thử nhanh với kit kiểm tra của Osborn, Hoa Kỳ với mẫu Ricin chuẩn (gồm chuỗi A và chuỗi B) được cung cấp từ Vectorlabs, Hoa Kỳ. Hàm lượng protein trong các phân đoạn được đo dưới bước sóng A280 bằng máy đo quang phổ kế.
Tiến hành gộp 2 phân đoạn có hàm lượng protein cao nhất, dung dịch thu được được kiểm tra bằng Phương pháp miễn dịch với kháng thể ricin và được gửi qua Mission Biotech Co., LTD., Đài Bắc, Đài Loan để định lượng ricin bằng Phương pháp khối phổ.
2.3.3.6. Phương pháp khối phổ
Khối phổ là một kỹ thuật phân tích giúp xác định hàm lượng và loại chất hóa học có trong mẫu dựa trên tỷ lệ khối lượng trên điện tích và số lượng của các ion pha khí.
Chất nghiên cứu được chuyển thành trạng thái hơi bằng phương pháp ion hóa trước khi được đưa vào bộ phận phân tích của máy khối phổ kế. Các phân tử ion được tạo thành sẽ được phân tách bằng tỉ lệ khối lượng trến điện tích. Cụ thể, bộ phận phân tích kiểm sốt chuyển động của các ion ion bằng các điện từ trường trong môi trường chân không. Ion được phân tách bằng cách gia tốc và tập trung thành một dòng tia đi tới bộ phận phát hiện. Các tín hiệu được phát hiện bằng bộ phận phát hiện và khuếch đại, cuối cùng kết quả được biểu diễn trên đồ thị ở dạng các đỉnh. Mỗi đỉnh thể hiện một đoạn của phân tử phân tích.
2.3.4. Phương pháp thử khả năng kháng khuẩn trên vi khuẩn
Tế bào vi khuẩn Bacilus cereus, E. coli, Staphylococcus aureus và Vibrio vulnificus (bảo quản trong glycerol 20%trong điều kiện -20oC) được lấy và rã đông ở nhiệt độ phịng cho tới khi tan hồn toàn.
Ngay sau khi tế bào được rã đông, dung dịch vi khuẩn được cấy ria 30µl vào đĩa thạch LB 2% agar và đặt trong tủ ấm 37oC trong 24 giờ. Thu 1 khuẩn lạc từ đĩa thạch vào 10ml dung dịch LB lỏng và nuôi lắc trong 37oC tới khi thu được giá trị A600 trong khoảng 0,5 đến 0,7. Dịch vi khuẩn được thu và pha loãng tới nồng độ 5x105 CFU/ml. Vi khuẩn đã pha loãng được chia vào ống effendorf 1,5ml và bổ sung ricin theo các nồng độ 0 mg/ml, 100mg/ml, 20mg/ml, 5mg/ml và đối chứng dương ceftriaxon 3µg/ml, ni cấy trong tủ ấm 37oC. Sau 24 giờ, pha loãng nồng dịch vi khuẩn đã xử lý ricin theo nồng độ 1:50, 1:100, 1:1000 và 1:10 000. Hút 50µl dịch vi khuẩn đã pha loãng vào trong đĩa thạch LB 2% agar và trải đều,tủ ấm 37oC.Sau 24 giờ, đếm số khuẩn lạc trên đĩa và lấy giá trị trung bình ở những đĩa mọc từ 20 đến 300 khuẩn lạc. Đơn vị tạo thành khuẩn lạc (CFU) được tính như sau:
CFU/ml= Trung bình số khuẩn lạc mọc trên đĩa x độ pha loãng.
2.3.5. Phương pháp đánh giá khả năng chống tế bào ung thư
2.3.5.1. Phương pháp ni cấy tế bào
Hoạt hóa và ni cấy tế bào
Thu tế bào ung thư da SKMEL28 và tế bào keratin HaCaT được bảo quản trong Ni tơ lỏng, rã đông bằng bể ổn nhiệt 37oC và đưa ngay vào tủ vô trùng.Đưa dung dịch chứa tế bào vào ống fancol chứa 3ml mơi trường ni cấy và ly tâm 1300 vịng/phút, bỏ dịch nổi, thu cặn tế bào. Cặn tế bào được hòa vào trong 10ml môi trường nuôi cấy phù hợp chứa 10% FBS và 1% peniciline, mix nhẹ để tạo thành dung dịch huyền phù tế bào rồi chuyển sang đĩa petri đã khử trùng, nuôi cấy trong tủ ấm 37oC, 5% CO2. Tế bào được kiểm tra hàng ngày, đến khi tế bào sinh trưởng đến 70-80% bề mặt đĩa, tiến hành cấy chuyển tế bào sang đĩa mới.
Thu tế bào từ đĩa nuôi cấy:
Loại bỏ môi trường nuôi cấy cũ, rửa tế bào với PBS 1x. Bổ sung dung dịch Trypsin 1x và ủ trong 5 phút 37oC, 5% CO2. Sau đó trung hịa Trypsine bằng mơi trường nuôi cấy chứa FBS, hút dịch và ly tâm 1300 vịng/phút trong 5 phút.
Thí nghiệm khảo sát độc tính của ricin lên tế bào ung thư da SKMEL28 và tế bào keratin thường HaCaT được thực hiện dựa trên phương pháp nhuộm tím tinh thể.
Thí nghiệm được tiến hành như sau: Tế bào SKMEL28 và HaCaT được nuôicấy trong môi trường RPMI đầy đủ tới mật độ thích hợp. Sau đó, cấy chuyển tế bào vào đĩa 6 giếng với mật độ 3x104 tế bào/giếng trong 3ml môi trường RPMI đầy đủ. Khi tế bào đã bám đĩa, bổ sung Ricin hòa tan trong PBS với các nồng độ: 10µl/ml, 1µl/ml, 100ng/ml, 50ng/ml, 10ng/ml, 5ng/ml, 1ng/ml, 0,5ng/ml, 0,1ng/ml, 0,05ng/ml và Đối chứng dương (10%PBS).Tế bào được ủ trong điều kiện 37°C, 5%CO2. Sau 48 giờ, quan sát, chụp ảnh và thu tế bào, loại bỏ môi trường nuôi cấy, cố định tế bào bằng cách bổ sung 1ml dung dịch formalin 10% và ủ trong 1 giờ.Loại bỏ formalin, nhuộm tế bào với tím tinh thể 0,1% trong 30 phút. Tiếp theo, rửa 5 lần với nước cất, để khô và ly giải tế bào đã nhuộm với SDS 0,1%. Đem dung dịch thu được đo tại bước sóng 560 nm bằng quang phổ kế.
Giá trị OD560 thu được được sử dụng để tính giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50%). Giá trị IC50 được tính theo phương pháp xây dựng đường cong đáp ứng liều theo công thức:
𝑦 = 𝐷 + 𝐴 − 𝐷
1 + 10(𝑥−𝑙𝑜𝑔𝐶 )𝐵
Với x là giá trị nồng độ ricin, y là giá trị OD560 đo được. Các thông số A, B, C, D được sử dụng để dựng hàm logarit và giá trị IC50 được tính tốn dựa trên thơng số C.
2.3.5.3. Phương pháp khảo sát tác động của ricin lên khả năng tạo khối u in-vitro
Thí nghiệm đánh giá khả năng tạo khối được thực hiện nhằm đánh giá khả năng ức chế của ricin lên quá trình tạo khối của tế bào ung thư SKMEL28.
Thí nghiệm được tiến hành như sau: Nuôi cấy tế bào SKMEL28 trong môi trường RPMI đầy đủ, điều kiện 37°C, 5% CO2 tới mật độ thích hợp. Thu tế bào và cấy chuyển tế bào vào đĩa 6 giếng với mật độ 3x104 tế bào/giếng trong 3ml môi trường RPMI đầy đủ.Sau khi tế bào đã bám đĩa, bổ sung ricin hòa tan trong PBS với
các nồng độ: 3ng/ml, 1ng/ml và 0ng/ml, ủ tế bào trong điều kiện 37°C, 5% CO2.Sau 48 giờ, tế bào được thu và trộn với agar 0,36% trong RPMI theo tỉ lệ 2,5x105 tế bào với 2ml agar RPMI.Nhỏ dịch tế bào và agar thu được lên agar 0,72% trong đĩa 6 giếng trong điều kiện 37°C, 5% CO2. Sau khi nuôi cấy trong 4 tuần, đếm những khối u có đường kính lớn hơn 50µm.
2.3.5.4. Phương pháp đánh giá tác động của ricin tới mức độ biểu hiện của một số protein marker của tế bào
Thu dịch chiết tế bào
Tế bào HaCaT và SKMEL28 đượctrong điều kiện thích hợp, khả năng tăng sinh tốt.Cấy chuyển tế bào sang đĩa petri mới, với mật độ thích hợp (40-50% đĩa). Tế bào được đặt cố định trong tủ ấm 37oC, 5% CO2 trong 3 giờ, để tế bào bám xuống đáy đĩa.Bổ sung ricin pha loãng trong PBS sao cho các nồng độ ricin cuối đạt được là 0ng/ml, 1ng/ml, 3ng/ml. Đặt trong tủ ấm 37oC, 5% CO2 trong.Sau 48 giờ, loại bỏ môi trường nuôi cấy và rửa sạch tế bào bằng PBS 1x lạnh 2 lần. Bổ sung vào mỗi đĩa 300µl đệm lysis (20 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 12,5 mM b- glycerophosphate, 1,5mM MgCl2, 2 mM EDTA, 10 mM NaF, 2 mM DTT, 1mM Na3VO4, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 20mM aprotinin, 0,5% Triton X- 100), giữ trên đá lạnh 5phút. Dùng que cào dồn tế bào về một đĩa và thu tịch tế bào vào ống eppendorf 1,5ml. Dung dịch thu được được ly tâm tại 14000 xg trong 15 phút, sau đó hútdịch nổi và bỏ xác tế bào. Nồng độ protein được xác định bằng phương pháp Bradford. Dịch chiết protein nội bào tổng sốđược sử dụng trong phương pháp lai miễn dịch với kháng thể ERK, p-ERK, Tubulin.
Điện di dịch chiết thu được trên gel SDS – PAGE.Sau đó lên chuyển màng nitrocellulose Hybond-P bằng phương pháp điện chuyển trong đệm Tris – Glycine chứa 10% Methanol trong 50p. Trong q trình điện chuyển màng, vị trí các băng protein được giữ nguyên.Tiến hành kỹ thuật thẩm tích sử dụng kháng thể đơn dòng (Tubulin, ERK và p-ERK) tỉ lệ 1:1000 trong bóng tối 1 giờ, tại nhiệt độ phịng. Các băng protein được phát hiện bằng dung dịch tráng phim và ghi nhận kết quả trên phim âm bản Kodak.
2.3.5.5. Phương pháp đánh giá tác động của ricin tới quá trình apoptosis của tế bào
Tác động của ricin lên chu trình tế bào, cụ thể là quá trình apoptosis, được đánh giá thông qua phương pháp đếm tế bào dòng chảy với thuốc nhuộm Annexin V và PI trên hai dịng tế bào HaCaT và SKMEL28.
Thí nghiệm được thực hiện theo quy trình của Schutte (1998) như sau:Tế bào HaCaT và SKMEL được nuôi cấy tới khi đạt điều kiện khỏe mạnh, sinh trưởng tốt