3.1. Kiểm tra hoạt tính của hạt thầu dầu
Mẫu hạt thầu dầu cung cấp bởi Viện dược liệu. Sau khi phân loại hạt thầu dầu tại Bộ mơn Sinh lý thực vật và hóa sinh, Đại học quốc gia Hà Nội, chúng tôi tiến hành thu dịch chiết tổng số theo phương pháp đã được mô tả trong nghiên cứu của TusharDhanani và cộng sự [54]. Sau khi nghiền nhỏ hạt thầu dầu, bổ sung nước khử ion theo tỉ lệ 1:10 (m/v) và nghiền siêu âm 35 kHz trong 5 phút trên đá lạnh. Đem mẫu ly tâm 3000 vòng/5 phút và loại bỏ cặn, thu dịch nổi. Thử khả năng kháng khuẩn của dịch chiết thu được với 4 chủng vi khuẩn E.coli,Staphylococcus aureus, Bacilus cereus và Vibrio vulnificus. Sau 24 giờ nuôi cấy vi khuẩn trong môi
trường LB lỏng bổ sung dịch chiết từ hạt thầu dầu, tế bào vi khuẩn được cấy ra đĩa thạch với tỉ lệ pha lỗng 1:1000.Độc tính của dịch chiết được xác định dựa vào số lượng khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa thạch sau 24 giờ cấy trải.
Kết quả thu được cho thấy, số lượng khuẩn lạc trên đĩa cấy vi khuẩn được nuôi trong LB lỏng bổ sung với dịch chiết hạt thầu dầu giảm đáng kể so với đĩa vi khuẩn nuôi trong LB lỏng. Cụ thể, với chủng vi khuẩn gram âm với 2 đại diện là
E.coli vàVibrio vulnificus , tỉ lệ khuẩn lạc sống sót sau khi xử lý với dịch chiết là 12% với E.coli và 0% với Vibrio vulnificus.
Hình 3.1: Kiểm tra khả năng kháng khuẩn của dịch chiết hạt thầu dầu lên vi khuẩn gram âm.
A. Đĩa thạch LB chứa khuẩn lạc E.coli không xử lý với dịch chiết hạt thầu dầu B. Đĩa thạch LB chứa khuẩn lạc E.coli xử lý với dịch chiết hạt thầu dầu
C. Đĩa thạch LB chứa khuẩn lạc Vibrio vulnificuskhông xử lý với dịch chiết hạt thầu dầu
D. Đĩa thạch LB chứa khuẩn lạc Vibrio vulnificusxử lý với dịch chiết hạt thầu dầu
Hình 3.2: Kiểm tra khả năng kháng khuẩn của dịch chiết hạt thầu dầu lên vi khuẩn gram dƣơng.
A. Đĩa thạch LB chứa khuẩn lạc Bacillus Cereus không xử lý với dịch chiết hạt thầu dầu
B. Đĩa thạch LB chứa khuẩn lạc Bacillus Cereus xử lý với dịch chiết hạt thầu
dầu
C. Đĩa thạch LB chứa khuẩn lạc Staphylococcus aureuskhông xử lý với dịch
chiết hạt thầu dầu
D. Đĩa thạch LB chứa khuẩn lạc Staphylococcus aureusxử lý với dịch chiết hạt thầu dầu
Đối với vi khuẩn gram dương với hai đại diện là Bacilus cereus
vàStaphylococcus aureus tỉ lệ khuẩn lạc sống sót là 0% [Hình3.2].
Như vậy, từ kết quả cho thấy dịch chiết thu được từ mẫu hạt thầu dầu có khả năng kháng khuẩn đối với 4 chủng vi khuẩn gram âm và gram dương. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Hashem Rahmati và cộng sự [20]. So sánh kết quả với nghiên cứu khác, chúng tôi khẳng định mẫu hạt thầu dầu thu thập tại Việt Nam có hoạt tính kháng khuẩn mạnh với các chủng vi khuẩn trên và đạt điều kiện để tiếp tục các nghiên cứu tiếp theo.
3.2. Thu dịch tách chiết và tinh sạch ricin từ hạt thầu dầu
3.2.1. Tách chiết protein tổng số
Hạt thầu dầu sau khi rửa sạch, ép và loại bỏ dầu được chiết trong dung dịch axit acetic 5% (v/v) để thu dịch protein tổng số. Với 100g hạt thầu dầu ban đầu, sau khi tách thu được 2,35mg/ml chiết lượng protein thô (Dịch chiết I). Tiếp tục tủa Dịch chiết protein I vừa thu được với dung dịch amoni sunfat với các nồng độ 30%, 40%, 50%, 60% và 70%. Sau đó đoOD280 của dịch chiết sau khi loại muốibằng quang phổ kế. Kết quả thu được được thể hiện trong Bảng3.1.
Bảng 3.1: Hiệu suất phân tách protein trong muối (NH4)2SO4 Dịch protein Thể tích Dịch protein Thể tích tổng (ml) Hàm lƣợng protein (mg/ml) Hàm lƣợng protein tổng số (mg) Hiệu suất tách chiết (%)
Protein thô trong axit acetic (5%) 300 2,25 675 - Tủa protein với (NH4)2SO4 30% 41 5,73 332,3 49,72 Tủa protein với (NH4)2SO4 40% 44 6,05 347,2 51,83 Tủa protein với (NH4)2SO4 50% 47 7,62 358,1 53,05 Tủa protein với (NH4)2SO4 60% 50 8,59 429,5 63,62 Tủa protein với (NH4)2SO4 70% 53 7,82 414,4 61,39
Với thể tích tổng ban đầu là 300ml, sau khi tủa với (NH4)2SO4 tỉ lệ 30%, 40%, 50%, 60% và 70%, thể tích protein thu được lần lượt là 44, 47, 50 và 53ml. Khi sử dụng (NH4)2SO4 60%, hàm lượng protein tổng số thu được cao nhất với hiệu suất 63,62%. Đồng thời, nồng độ protein thu được tại nồng độ này cao nhất, chênh lệch 0,77 mg/ml so với protein thu được với (NH4)2SO4 70%.
Điện di dịch chiết protein thu được sau khi tủa với muối trên gel SDS – PAGE để kiểm tra hàm lượng protein trong mẫu. Kết quả kiểm tra trên gel SDS – PAGE (Hình 3.3) cho thấy hàm lượng protein cao nhất tại khi tủa protein với dung dịch (NH4)2SO4 60% (đường chạy thứ 5, Hình 3.3). Đồng thời băng kích thước 64kD (được dự đốn là ricin) có kích thước lớn nhất tại đường chạy protein tủa với dung dịch (NH4)2SO4 60%.
Hình 3.3: SDS-PAGE kiểm tra protein sau khi tủa với các nồng độ khác nhau của (NH4)2SO4: 30% (đƣờng chạy 1), 40% (đƣờng chạy 2), 50% (đƣờng chạy 3), 60% (đƣờng chạy 4) và 70% (đƣờng chạy 5)
Từ các kết quả thu được, có thể khẳng định nồng độ muối (NH4)2SO4 tối ưu để tủa dịch chiết I là 60% (m/v). Do vậy, chúng tôi tiếp tục sử dụng dung dịch (NH4)2SO4 60% để tủa protein từ Dịch chiết I và tiến hành kiểm tra sự có mặt của ricin trong protein thu được sau khi tủa bằng kit phát hiện nhanh của Osborn, Hoa Kỳ. Kit có giới hạn phát hiện là 50ng.
3.2.2. Tinh sạch ricin từ protein tổng số
Kết quả kiểm tra cho thấy dịch chiết protein thu được sau khi tủa (Dịch chiết II) có chứa ricin. Chúng tơi tiến hành tinh sạchDịch chiết II bằng phương pháp sắc ký ái lực DEAE – sepharose. Sau khi gắn Dịch chiết protein II lên cột, rửa cột với dung dịch đệm Tris – HCl 0,05M để loại bỏ các protein gắn không đặc hiệu với cột DEAE – sepharose. Protein gắn cột được rửa chiết với dung dịch đệm Tris – HCl 0,05M pH 8,0 bổ sung NaCl 0,05M. Các phân đoạn sau khi rửa chiết được kiểm tra
sự có mặt của ricin bằng kit nhanh và đo ODbằng máy quang phổ kế tại bước sóng 280nm.
Kết quả kiểm tra cho thấy, ricin xuất hiện tại phân 4 phân đoạn 8, 9, 10 và 11. So sánh hàm lượng protein của các phân đoạn đã tinh sạch (Hình3.4), từ vị trí cực đại của peak protein cho thấy hàm lượng protein cao nhất ở phân đoạn 9 và 10.
Hình 3.4: Hàm lƣợng protein qua các phân đoạn sau khi chạy sắc ký trao đổi ion DEAE - sepharose
Chúng tôi chọn 2 phân đoạn 9 và 10 chứa ricin và có hàm lượng protein cao hơn các phân đoạn còn lại để tiếp tục nghiên cứu. Hai phân đoạn này được trộn với nhau (thành Dịch chiết III) và tinh sạch bằng phương pháp sắc ký lọc gel sephadex G100. Dịch chiết protein III được gắn lên cột gel sephadex G100 và rửa chiết với dung dịch đệm phosphate 0,002M với vận tốc 0,2mL/phút. Kiểm tra sự có mặt của ricin trong mỗi phân đoạn thể tích 2ml bằng kit Osborn.
Sau khi kiểm tra, gộp các phân đoạn chứa ricin thu được khi chạy qua sắc ký lọc gel Sephadex G100 và kiểm tra độ tinh sạch của dung dịch thu được (Dịch chiết IV) bằng thẩm tách miễn dịch.Dịch chiết IV được xử lý với 2 mercaptoethanolamide (2-ME) để cắt cầu đisunfit nối chuỗi A và chuỗi B trong
phân tửricin. Do vậy, ricin sẽ phân mảnh thành 2 đoạn protein là chuỗi A và chuỗi B có kích thước lần lượt là 30kD và 34kD.
Dịch chiết IV có và khơng xử lý với 2-ME được đưa về hàm lượng protein giống nhau, chạy điện di trên trên SDS – PAGE và thẩm tách miễn dịch sử dụng kháng thể ricin. Các kết quả được thể hiện trong Hình3.5, mẫu protein khơng xử lý với 2-ME (đường chạy 1) cho kết quả 1 băng kích thước 64kDa đậm ứng với phân tử ricin nguyên vẹn. Mẫu protein xử lý với 2-ME (đường chạy 2) cho kết quả là 2 băng kích thước 30kDa và 34kDa ứng với kích thước của chuỗi A và chuỗi B trong phân tử ricin. Kết quả này cho thấy 2-ME cắt thành công cầu đisunfit nối 2 chuỗi A và B trong phân tử ricin và góp phần khẳng định trong mẫu protein Dịch chiết IV chứa ricin.
Hình 3.5: Thẩm tách miễn dịch kiểm tra độ tinh sạch của ricin sau khi qua sắc ký lọc gel Sephadex G100
A. Ricin tổng số sau qua sắc ký lọc gel Sephadex G100 (đƣờng chạy 1), ricin tổng số đƣợc xử lý với 2-Me (đƣờng chạy 2)
B. Thang ricin chuẩn với 2 chuỗi ricin A (đƣờng chạy 1) và chuỗi ricin B (đƣờng chạy 2)
Kích thước 2 băng đơi được so sánh với kích thước thang ricin chuẩn chuỗi A và chuỗi B được cung cấp bởi Vectorlab, Hoa Kỳ. Quan sát thấy 2 băng đôi
B A
tương ứng với chuỗi A và chuỗi B của mẫu có kích thước giống với thang ricin chuẩn. Độ đậm của các băng của mẫu cũng tương ứng với thang chuẩn, cụ thể, độ đậm của chuỗi A nhỏ hơn chuỗi B tương tự giữa 2 mẫu.Qua đây, có thểxác định băng 64kDa thu được là ricin.
Từ các kết quả trên, chúng tôi khẳng địnhsơ bộ đã tách chiết và tinh sạch thành công ricin từ hạt thầu dầu. Với hiệu suất các quá trình được thể hiện trong Bảng 5. Từ 100g hạt thầu dầu ban đầu, qua 4 bước tách chiết và tinh sạch thu được 13,2g ricin. Hiệu suất của cả quá trình là 9%.
Bảng 3.2: Quy trình 4 bƣớc phân tách và tinh sạch ricin từ hạt thầu dầu
Thể tích tổng (ml) Hàm lƣợng protein (mg/m) Hàm lƣợng protein (mg) Hiệu suất tách chiết và tinh sạch (%)
Dịch protein trong acetic acid 5% (I) 1000 2250 2250 100 Tủa protein bằng (NH4)2SO460% (II) 166,5 8,59 1430,2 63,6 Phân tách protein bằng sắc ký trao đổi
ion DEAE Sepharose (III) 34 4,3 146,2 10,3
Tinh sạch protein sử dụng sắc ký lọc
gel sephadex G100 (IV) 11 1,2 13,2 9,0
Để khẳng định mẫu protein có kích thước 64kDa thu được là ricin, chúng tơi tiến hành định lượng mẫu protein được định lượng bằng phương pháp khối phổ. Cụ thể, mẫu được gửi tới Misision Biotech Co., LTD, Đài Bắc, Đài Loan để kiểm tra và kiểm định protein thu được là ricin và đã được tinh sạch. Thu protein bằng kỹ thuật thôi gel bằng trypsine với băng protein kích thước 64kDa trong thí nghiệm thẩm tách miễn dịch và đưa đi nhận dạng bằng sắc ký lỏng kết hợp khối phổ LC-
MS/MS.Protein được tìm kiếm bằng phần mềm Mascot v.1.8 (MatrixScience Ltd., London, UK) trên cơ sở dữ liệu NCBInr.
Hình 3.6: Trình tự ricin từ EST gi|255587301
Sau khi chạy khối phổ, chuỗi protein bị phân cắt thành các mảnh mang điện tích khác nhau. Các mảnh của chuỗi peptide tạo thành các đỉnh b, y và được đánh dấu trong MS/MS. Sau khi so sánh phổ MS/MS thu được với trình tựchuỗi amino axit của ricin từ kho dữ liệu EST (Hình 3.6), chúng tơi nhận được 4 đoạn peptide HEIPVLPNR (Hình 3.7A), SFIICIQMISEAAR (Hình 3.7B), SAPDPSVITLENSWGR (Hình 3.7C) và LSTAIQESNQGAFASPIQLQR (Hình 3.7D) tương đồng với trình tự chuẩn.
Hình 3.7: Phổ khối phổ của các đoạn peptide HEIPVLPNR (A), SFIICIQMISEAAR (B), SAPDPSVITLENSWGR (C) và LSTAIQESNQGAFASPIQLQR (D) A B C D
Kết quả thí nghiệm cho thấy, mẫu protein thu được từ bản gel SDS – PAGE có kích thước và trình tự tương đồng với ricin. Do vậy, chúng tôi khẳng định đã thành công trong việc tách chiết và tinh sạch ricin từ hạt thầu dầu và sử dụng mẫu ricin này vào các thí nghiệm đánh giá hoạt tính tiếp theo.
3.3. Khả năng kháng khuẩn của ricin tinh sạch
Trong thí nghiệm này, chúng tôi thử khả năng kháng khuẩn của ricin tinh sạch thu được lên 4 chúng vi khuẩn (2 chủng gram âm và 2 chủng gram dương) đã tiến hành khảo sát độc tính của dịch chiết hạt thầu dầu thơ trước đó. Bốn chủng vi khuẩn E.coli,Staphylococcus aureus, Bacilus cereus và Vibrio vulnificus được ni cấy trong mơi trường LB lỏng có hoặc khơng bổ sung dịch chiết từ hạt thầu dầu tại các nồng độ khác nhau là 5µg/ml, 20µg/ml và 100µg/ml và ceftriaxon 3µg/ml (như là đối chứng dương). Sau đó 24 giờ,tế bào vi khuẩn được cấy ra đĩa thạch với tỉ lệ pha loãng 1:10 000 (v/v). Độc tính của dịch chiết được xác định dựa vào số lượng/độ sống của khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa thạch sau 24 giờ cấy trải.Kết quả thu được được thể hiện trong Hình 3.8.
Hình 3.8: Tác động của ricin lên khả năng sống sót của các chủng vi khuẩn sau khi xử lý với ricintrong 24 giờ
Dựa vào kết quả ta thấy, đối với hai chủng vi khuẩn gram âm là E.coli và Vibrio vulnificus, tỉ lệ tế bào sống sót so với đối chứng chênh lệch rất rõ rệt. Cụ thể,
với E.coli, ricin thu được có tác dụng kìm hãm vi khuẩn sinh trưởng tuy nhiên ko
gây chết hoàn toàn, tỉ lệ vi khuẩn sống sót giảm 60% tại nồng độ 100µg/ml và tăng dần tại nồng độ thấp hơn.Với chủng vi khuẩn gram âm còn lại, Vibrio vulnificus,
ricin có tác động rõ rệt tới khả năng sống sót của loại vi khuẩn này khi vi khuẩn bị tiêu diệt gần như hoàn toàn tại hầu hết các nồng độ. Tại nồng độ 20 µg/ml, tỉ lệ vi khuẩn sống sót đạt mức 1,7% so với đối chứng.
Đối với hai chủng vi khuẩn gram dương Bacillus Cereus và Staphylococcus aureus, Ceftriaxon khơng có tác động đến hai chủng vi khuẩn này.Tại nồng độ
20µg/ml, 2 chủng vi khuẩn này đều có tỉ lệ sống sót giảm60 - 70% so với đối chứng. Sau khi xử lý với ricin tinh sạch, tỉ lệ vi khuẩn Bacillus Cereus sống sót giảmhơn 80% tại nồng độ 100µg/ml, tại nồng độ thấp hơn 20µg/ml tác động diệt khuẩn khuẩn B. cereusgiảm. Khả năng sống của chủng vi khuẩn Staphylococcus aureusgim ẵ ti nng 100àg/ml v gim 1/3 tại nồng độ 20µg/ml sau khi xử lý
với ricin tinh sạch.Dịch chiết thơ có tác dụng tiêu diệt gần như hồn tồn vi khuẩn trong ricin tinh sạch lại có hoạt tính thấp hơn.
Các kết quả tìm được cho thấy, ricin thu được qua bước tinh sạch có khả năng kháng khuẩn từ nồng độ cao hơn 20µg/ml. Các nghiên cứu trước đó của Hashem Rahmati và cộng sự [20] đánh giá trên các chủng vi khuẩn S. aureus và E.coli đã chỉ ra nồng độ gây chết (MIC) của dịch chiết ricin thô (9MeOH:1H2O, v:v) đạt giá trị lần lượt trong khoảng 9µg/mlvà 2,47µg/ml. Các kết quả này thấp hơn nhiều so với kết quả nghiên cứu vừa thu được (với ngưỡng MIC nằm trong khoảng 5µg/ml-200µg/ml). Tuy nhiên, điều này cũng có thể giải thích bằng thành phần của dịch chiết trong nghiên cứu của Hashem bao gồm nhiều nhóm hợp chất có khả năng kháng khuẩn khác như Sapoin, Anthocyanin, Vitamin A,Sterol… Tóm lại, ricin thu được có khả năng diệt khuẩn 4 chủng vi khuẩnE.coli, Staphylococcus aureus,
Bacilus cereus và Vibrio vulnificustại nồng độ từ 5µg/ml trở lên.
3.4. Khả năng ức chế của ricin tinh sạch lên tế bào in vitro
Sau khi đánh giá được khả năng kháng khuẩn của ricin tinh sạch lên tế bào vi khuẩn, chúng tơi tiếp tục thí nghiệm đánh giá tác động của ricin thu được lên tế bào
động vật với 2 đại diện là tế bào ung thư da SKMEL28 và tế bào keratinocyteHaCaT.
3.4.1. Độc tính của Ricin lên tế bào ung thư da SKMEL28 và tế bào HaCaT.
Ricin sau khi được tinh sạch, được đông khô dưới dạng tinh thể và bảo quản trong điều kiện -20oC. Tế bào SKMEL28 và HaCaT được nuôi cấy trong môi trường phù hợp và có tốc độ sinh trưởng tốt, được bố sungricin theo dải nồng độ (nồng độ cuối cùng trong giếng) 0,5 ng/ml, 1,0 ng/ml, 2,5 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml và 1000 ng/ml. Sau 48h, tác động của ricin lên khả năng sống sót của hai dòng tế bào HaCaT và SKMEL28 theo các nồng độ trên được ghi nhận và thể hiện lần lượt trong Hình 3.9 và Hình 3.10.
Hình 3.9: Độc tính của ricin lên dịng tế bào HaCaT.
A – H: Hình ảnh HaCaT đƣợc xử lý với các nồng độ: 0,0 ng/ml (A), 0,5 ng/ml (B), 1,0 ng/ml (C), 2,5 ng/ml (D), 5 ng/ml (E), 10 ng/ml (F), 100 ng/ml (G) và 1000 ng/ml (H)trong 48 giờ
I: Đƣờng độc tính của ricin lên tế bào HaCaT sau 48h
Đối với dòng tế bào HaCaT, sau khi xử lý với ricin số lượng tế bào giảm mạnh tại nồng độ 2,5ng/ml và các nồng độ cao hơn. Tại nồng độ 5ng/ml, xuất hiện tế bào bị biến dạng và mảnh vỡ của tế bào chết. Tại nồng độ 100ng/ml trở đi các tế bào co cụm, biến dạng và hồn tồn khơng cịn khả năng sống sót. Chỉ số IC5048h của ricin lên HaCaT được đánh giá qua giá trị OD560 và có giá trị là 5,2ng/ml