3.2 .Thu dịch tách chiết và tinh sạch ricin từ hạt thầu dầu
3.2.1 .Tách chiết protein tổng số
Hạt thầu dầu sau khi rửa sạch, ép và loại bỏ dầu được chiết trong dung dịch axit acetic 5% (v/v) để thu dịch protein tổng số. Với 100g hạt thầu dầu ban đầu, sau khi tách thu được 2,35mg/ml chiết lượng protein thô (Dịch chiết I). Tiếp tục tủa Dịch chiết protein I vừa thu được với dung dịch amoni sunfat với các nồng độ 30%, 40%, 50%, 60% và 70%. Sau đó đoOD280 của dịch chiết sau khi loại muốibằng quang phổ kế. Kết quả thu được được thể hiện trong Bảng3.1.
Bảng 3.1: Hiệu suất phân tách protein trong muối (NH4)2SO4 Dịch protein Thể tích Dịch protein Thể tích tổng (ml) Hàm lƣợng protein (mg/ml) Hàm lƣợng protein tổng số (mg) Hiệu suất tách chiết (%)
Protein thô trong axit acetic (5%) 300 2,25 675 - Tủa protein với (NH4)2SO4 30% 41 5,73 332,3 49,72 Tủa protein với (NH4)2SO4 40% 44 6,05 347,2 51,83 Tủa protein với (NH4)2SO4 50% 47 7,62 358,1 53,05 Tủa protein với (NH4)2SO4 60% 50 8,59 429,5 63,62 Tủa protein với (NH4)2SO4 70% 53 7,82 414,4 61,39
Với thể tích tổng ban đầu là 300ml, sau khi tủa với (NH4)2SO4 tỉ lệ 30%, 40%, 50%, 60% và 70%, thể tích protein thu được lần lượt là 44, 47, 50 và 53ml. Khi sử dụng (NH4)2SO4 60%, hàm lượng protein tổng số thu được cao nhất với hiệu suất 63,62%. Đồng thời, nồng độ protein thu được tại nồng độ này cao nhất, chênh lệch 0,77 mg/ml so với protein thu được với (NH4)2SO4 70%.
Điện di dịch chiết protein thu được sau khi tủa với muối trên gel SDS – PAGE để kiểm tra hàm lượng protein trong mẫu. Kết quả kiểm tra trên gel SDS – PAGE (Hình 3.3) cho thấy hàm lượng protein cao nhất tại khi tủa protein với dung dịch (NH4)2SO4 60% (đường chạy thứ 5, Hình 3.3). Đồng thời băng kích thước 64kD (được dự đốn là ricin) có kích thước lớn nhất tại đường chạy protein tủa với dung dịch (NH4)2SO4 60%.
Hình 3.3: SDS-PAGE kiểm tra protein sau khi tủa với các nồng độ khác nhau của (NH4)2SO4: 30% (đƣờng chạy 1), 40% (đƣờng chạy 2), 50% (đƣờng chạy 3), 60% (đƣờng chạy 4) và 70% (đƣờng chạy 5)
Từ các kết quả thu được, có thể khẳng định nồng độ muối (NH4)2SO4 tối ưu để tủa dịch chiết I là 60% (m/v). Do vậy, chúng tôi tiếp tục sử dụng dung dịch (NH4)2SO4 60% để tủa protein từ Dịch chiết I và tiến hành kiểm tra sự có mặt của ricin trong protein thu được sau khi tủa bằng kit phát hiện nhanh của Osborn, Hoa Kỳ. Kit có giới hạn phát hiện là 50ng.