Chƣơng 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.4 Quy trình tạo chế phẩm visinh vật đối kháng dạng bột
* Nghiên cứu sản xuất chế phẩm dạng bột đối với chủng B. subtilis N5 - Nhân sinh khối Bacillus
Xác định các thông số lên men phù hợp của chủng Bacillus đối kháng
- Xác định môi trường lên men sinh khối: Vi khuẩn được lên men ở 5 loại môi trường khác nhau bao gồm: King B, NB, SX1, SX2, SX3. Thời gian lên men và xác định số lượng tế bào vi khuẩn/ml ở mỗi loại môi trường ở các điều kiện lên men phù hợp.
- Xác định nhiệt độ thích hợp: Tiến hành ở các nhiệt độ là 25°C, 30°C, 37°C, 42oC. Nhiệt độ lên men sinh khối tối ưu khi mật độ tế bào là cao nhất và hoạt tính của vi sinh vật phải ổn định
- Xác định pH phù hợp: Kế thừa điều kiện tối ưu từ 2 phương pháp trên, pH môi trường được điều chỉnh ở mức: 6; 6.5; 7,0; 7,5 và 8. Đếm số lượng tế bào/ml ở mỗi giá trị pH.
- Xác định tốc độ cánh khuấy phù hợp: Để tăng tốc độ hòa tan của oxy vào dung dịch nhân sinh khối. Các thí nghiệm xác định tốc độ cánh khuấy phù hợp được tiến hành ở các tốc độ: 200, 250, 300, 350 và 400 vòng/phút với các điều kiều kiện tối ưu ở trên.
- Xác định thời gian lên men phù hợp: Xác định thời gian lên men thích hợp ở các thời điểm 18; 24; 30; 36; 48 giờ.
- Xác định tỷ lệ giống cấp 1: Với những điều kiện tối ưu đã được lựa chọn như trên, tỷ lệ giống cấp I được ở mức khác nhau từ 0.5%; 1%; 2%; 4%; Giống cấp I được nhân trên môi trường chuẩn, và được kiểm tra độ thuần khiết.
34
- Lựa chọn chất mang phù hợp để phối trộn với sinh khối Bacillus đối kháng
Nguyên liệu:
- Sinh khối Bacillus sau khi lên men
- Chất mang: gồm 4 loại khác nhau: cám, bột ngô, than bùn, tinh bột sắn. Các chất mang được khử trùng khô ở 140oC trong 4 giờ.
Tiến hành:
Chất mang và sinh khối Bacillus được trộn với nhau theo tỉ lệ 1:1. Chế phẩm được đem đi sấy khô ở 40oC, trong 4 giờ. Thường xuyên kiểm tra đảo đều trong thời gian sấy, đảm bảo độ ẩm sau sấy đạt được từ 15 - 20%. Chế phẩm sau sấy khô sẽ được kiểm tra mật độ. Vi khuẩn mật độ phải đạt được ≥ 106 CFU/g. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm gián tiếp trên môi trường LB để lựa chọn ra cơ chất phù hợp.
* Nghiên cứu điều kiện lên men xốp đối với nấm Trichoderma
Các cơ chất được sử dụng trong thí nghiệm trong nghiên cứu sản xuất chế phẩm bao gồm: gạo, thóc, vỏ trấu, cám gạo và bột ngơ, than bùn. Đây là các cơ chất thường được sử dụng trong lên men bán xốp. Thí nghiệm được tiến hành song song trên cả 6 cơ chất trên để tìm ra nguồn cơ chất phù hợp nhất với chủng Trichoderma. Nguyên liệu:
- Bào tử nấm Trichoderma điều chỉnh về 106
bào tử/ml.
- Chất mang: gồm các loại cơ chất trên. Mỗi loại được bổ sung với lượng nước thích hợp, sau đó đem khử trùng ở 121°C trong thời gian 40 phút.
Tiến hành
- Bổ sung 10 ml dịch bào tử nấm vào 250g cơ chất mỗi loại, trộn đều, để ở nơi thoáng mát nhiệt độ từ 25-30°C. Sau 5-15 ngày nuôi cấy, chế phẩm sẽ được sấy trong tủ sấy ở 30°C đến khi đạt độ ẩm khoảng 20% .
35
- Tiến hành đếm số lượng bào tử thu được trong 1g cơ chất. So sánh lượng bào tử thu được ở các cơ chất khác nhau và thời gian thu được sản phẩm để chọn ra cơ chất phù hợp nhất dùng làm chế phẩm.
* Nghiên cứu điều kiện lên men xốp đối với chủng xạ khuẩn
Thí nghiệm được tiến hành song song trên cả 6 cơ chất trên để tìm ra nguồn
cơ chất phù hợp nhất với chủng xạ khuẩn. Chủng xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường thạch ISP4, sau 5 ngày ở 30°C được chia nhỏ và chuyển sang nuôi cấy trên 6 loại môi trường bán rắn khử trùng. Sau khi nuôi cấy ở điều kiện 30°C, tránh ánh sáng trực tiếp, xạ khuẩn được theo dõi thường xuyên để kiểm soát hiện tượng nhiễm khuẩn hoặc bào tử nấm trong môi trường, đảo trộn để xạ khuẩn sinh trưởng trên tồn bộ mơi trường rắn. Sau 5 ngày, xạ khuẩn hình thành các khuẩn lạc trắng (khi chưa sinh bào tử) và xám (khi phát sinh bào tử) bên trong môi trường rắn, sự nhiễm khuẩn hoặc nấm khác thường làm cho xạ khuẩn mọc yếu trên chế phẩm, khơng có xuất hiện vi nấm mốc và sự phát triển của chủng xạ khuẩn trên cả bề mặt túi là túi chế phẩm có thể sử dụng được.
=> Sau khi tiến hành tạo chế phẩm riêng rẽ đối với mỗi chủng, tiến hành phối trộn hỗn hợp gồm ba chủng với tỷ lệ 1:1:1. Chế phẩm được bảo quản ở nhiệt độ phòng để theo dõi mật độ vi sinh vật theo thời gian.
2.3.5. Bƣớc đầu thử nghiệm hiệu quả của chế phẩm trên đồng ruộng
Thử nghiệm chế phẩm chống bệnh thán thư trên cây ớt:
- Địa điểm thực hiện thí nghiệm tại vườn ớt tại huyện Yên Mỹ, xã Hồn Long, tỉnh Hưng n. Giống ớt trồng trong thí nghiệm là ớt chỉ thiên cho thu hoạch trái sau 60 ngày. Thí nghiệm gồm 2 khối liền kề nhau, mỗi khối 20 cây. Khoảng cách giữa các cây trong cùng một khối khoảng 0.5 m. Thí nghiệm được tiến hành sau khi các cây ớt đã xuống giống được 1 tháng. Chế độ chăm sóc, phân bón được thực hiện như nhau với cả hai lơ. Thời gian thực
36
hiện thí nghiệm từ 10/4/2018 đến 25/4/2018. Đây là thời gian có khí hậu ẩm ướt, lượng mưa nhiều, dịch thán thư bùng phát mạnh trên ớt.
- Dấu hiệu nhận biết bệnh thán thư: bệnh gây hại trên nhiều bộ phận của cây như lá thân và quả. Trên lá, vết bệnh hình trịn hoặc khơng có hình dạng nhất định, xếp theo chiều dài của gân lá. Lúc đầu, đốm bệnh ở mặt dưới lá có màu nâu nhạt, sau chuyển màu nâu sậm, có viền đỏ, lan rộng và lõm sâu. Trên cuống lá và thân cây vết bệnh cũng lõm xuống tạo thành vết dọc màu nâu đen.
- Lô đối chứng âm (ĐC âm): không sử dụng các chế phẩm kiểm soát nấm bệnh.
- Cách sử dụng chế phẩm: chế phẩm có mật độ tối thiểu 2x108 bào tử/g mỗi loại bào tử vi khuẩn Bacillus, xạ khuẩn và Trichoderma. Hòa tan 10 g chế
phẩm vào 10 lít nước sạch, phun đều lên tồn bộ các cây và tưới vào gốc của lơ thí nghiệm, lượng bào tử mỗi loại vi sinh vật phun lên mỗi cây khoảng 1x108. Sau khoảng thời gian 2 tuần, xác định hiệu quả chống bệnh thán thư
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Phân lập và sàng lọc các chủng vi sinh vật có hoạt tính kháng nấm gây bệnh trên cây trồng bệnh trên cây trồng
3.1.1 Phân lập và sàng lọc các chủng vi khuẩn có hoạt tính kháng nấm
Phân lập các chủng vi khuẩn từ vùng rễ cây trồng
Các mẫu đất được thu từ vùng rễ của những cây khác nhau như cây ớt, đậu tương, lạc, lúa... trên địa bàn như Hà Nội, Bắc Ninh, Thái Bình, Thanh Hóa... Kết quả đã phân lập thu được 294 chủng vi khuẩn (Bảng 1). Các chủng này được thuần khiết và giữ giống bằng phương pháp đông khô để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
Bảng 1. Số lượng vi khuẩn phân lập được từ các mẫu đất thu được
Nguồn Địa bàn Số lƣợng vi khuẩn
thu đƣợc Tổng Ớt Hà Nội 30 88 Bắc Giang 27 Bắc Ninh 31 Đậu tương Hà Nội 30 62 Bắc Ninh 32 Lạc Bắc Giang 21 56 Bắc Ninh 35 Lúa Thái Bình 25 48
Đậu xanh Thanh Hóa 23
Đất rừng ngập mặn Cát Bà 40 40
Tổng số 294
Trên thế giới, các nghiên cứu trong hơn thập niên qua, đã ghi nhận có nhiều chủng vi khuẩn vùng rễ vừa kích thích cây sinh trưởng, vừa là tác nhân phịng trừ sinh học các bệnh có nguồn gốc từ đất theo cơ chế đối kháng [60]. Do đó, với hệ
sinh thái vùng đất rễ cây trồng, khả năng có thể tìm ra các chủng vi khuẩn có hoạt tính sinh học cao là rất lớn.
Sàng lọc các chủng vi khuẩn có hoạt tính kháng nấm
Bước đầu lựa chọn các chủng vi khuẩn có khả năng kháng nấm, 294 chủng vi khuẩn phân lập được được kiểm tra khả năng kháng 8 nấm kiểm bằng phương pháp chấm điểm trên môi trường PDA. Kết quả thu được 144 trên tổng số 294 chủng có hoạt tính kháng nấm. Tiếp tục sàng lọc 144 chủng vi khuẩn dựa trên khả năng kháng các nấm gây bệnh theo phương pháp đặt thạch để xác định đường kính vịng kháng nấm, kết quả cho thấy, 11 chủng có khả năng kháng nấm mạnh nhất và kháng đồng thời nhiều nấm gây bệnh khác nhau (Bảng 2)
Bảng 2. Hoạt tính kháng nhiều nấm của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
Chủng P . ca p sici F . o xy sp o ru m S clero tiu m sp . N . d imid ia tu m A . n ig er A . fla vu s P . d ig ita tu m C o llecto tr ich u m sp . N5 + ++ +++ ++++ ++++ ++ ++++ ++++ BNK8 + + +++ ++ +++ - +++ - BNK2.3 + + +++ ++ +++ - ++ - DH4.9 + + +++ +++ +++ + +++ - DH4.15 + ++ +++ ++++ ++++ + +++ +++ LU4.4 + + +++ +++ ++++ + +++ - BNK 7.1 + + +++ +++ +++ - ++ - BRK4.5 + + +++ +++ +++ - ++ - H2.7 + + +++ +++ +++ - ++ - H3.5 + + +++ +++ +++ - ++ - DT3.5 + + +++ +++ +++ - ++ -
Ghi chú: (-): Khơng có khả năng đối kháng; (+): Kháng yếu; (++): Kháng trung bình, đường kính từ 2-6mm; (+++): Kháng mạnh, đường kính vịng kháng từ 7-10mm; (++++): Kháng rất mạnh, đường kính vịng kháng từ
Kết quả kiểm tra hoạt tính kháng nấm theo phương pháp đặt thạch cho thấy 4 chủng LU 4.4, DH4.15, DH4.9 và N5 trong 11 chủng được lựa chọn có khả năng kháng nhiều nấm bệnh khác nhau với hoạt tính mạnh nhất. Đặc biệt, chủng N5 thể hiện hoạt tính kháng mạnh nhất trong 4 chủng, với nấm P. digitatum, A. niger, N. dimidiatum và Collectotrichum gây bệnh trên ớt, đường kính vịng kháng nấm lần lượt là: 17 ±1mm, 24 ±1mm, 12 ±1mm và 11±1mm.
3.1.2 Phân lập và sàng lọc các chủng Trichoderma có hoạt tính kháng nấm
Các mẫu được thu ở vùng rễ của các cây khác nhau như ớt, lạc, đậu xanh, ngô, rau và vỏ của quả bị nhiễm nấm trên địa bàn Nam Định, Thanh Hóa, Vĩnh Phúc, Hà Nội được phân lập trên mơi trường PDA có bổ sung kháng sinh phổ rộng chloramphenicol để ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn. Dựa trên màu sắc và hình thái đặc trưng của nấm Trichoderma trên đĩa phân lập để chọn lọc và làm thuần chủng Kết quả phân lập thu được 10 chủng nấm với đặc điểm giống với vi nấm
Trichoderma (Bảng 3). Cả 10 chủng đều sinh trưởng và phát triển tốt trên môi
trường PDA ở nhiệt độ 25-28°C, hệ sợi nấm tạo thành những vòng tròn đồng tâm (đặc trưng của chủng Trichoderma) với màu xanh đậm nhạt khác nhau. 10 chủng
được ký hiệu từ Tr.1- Tr.10.
F. oxysporum A. flavus
N. dimidiatum
P. digitatum A. niger Collectotrichum DH4.15 DH4.15 DH4.15 DH4.15 DH4.15 N5 N5 DH4.9 DH4.9 DH4.9 DH4.9 LU4.4 LU4.4 LU4.4 LU4.4 DH4.9 LU4.4 N5 LU4.4 DH4.15 DH4.9
Hình 6. Hình thái khuẩn lạc của các chủng Trichoderma phân lập được từ các mẫu
đất, vỏ quả
Bảng 3. Số lượng chủng Trichoderma phân lập được từ các mẫu đất, vỏ quả
Nguồn Địa bàn Đặc điểm Kí hiệu
Vỏ quả thanh long Hà Nội Nấm có màu trắng sau chuyển sang màu xanh Tr.1
Đất trồng ớt
Nam Định Nấm có màu trắng sau chuyển sang màu xanh Tr.4 Tr.6
Thanh Hóa Nấm có màu trắng sau chuyển sang màu xanh
Tr.2 Tr.3 Đất trồng đậu xanh Vĩnh Phúc Nấm có màu trắng sau chuyển sang màu xanh Tr.5
Đất trồng rau
Thanh Hóa Nấm có màu trắng sau chuyển sang màu xanh Tr.7
Nam Định Nấm có màu trắng sau chuyển sang màu xanh Tr.9 Đất trồng lạc Nam Định Nấm có màu trắng sau chuyển sang màu xanh Tr.8 Đất trồng ngô Vĩnh phúc Nấm có màu trắng sau chuyển sang màu xanh vàng Tr.10
Xác định khả năng kháng nấm của vi nấm Trichoderma
Tất cả 10 chủng Trichoderma đã phân lập được tiến hành kiểm tra khả năng đối kháng với một số nấm gây bệnh cây trồng ở Việt Nam như F. oxysporum, S. hydrophilum, P. capsici, N. dimidiatum, A. flavus, A. niger, P. digitatum trên môi
trường PDA. Sau khi được cấy trên cùng một đĩa, cả hai loại nấm Trichoderma và nấm bệnh đều phát triển và lan nhanh trên môi trường. Kết quả kiểm tra hoạt tính kháng nấm cho thấy tất cả các chủng Trichoderma đều có khả năng kháng đa nấm với các mức độ khác nhau. Mức độ đối kháng được tính bằng cách đo đường kính của nấm gây bệnh cây trồng trên đĩa được cấy cả nấm Trichoderma (Bảng 4).
Bảng 4. Khả năng đối kháng nấm gây bệnh của các chủng Trichoderma
F. oxysporum S. hydrophilum P. capsici N. dimidiatum A. flavus A. niger P. digitatum
Tr.1 ++ ++ ++ ++ + +++ +++ Tr.2 +++ +++ ++ +++ + +++ +++ Tr.3 + +++ ++ ++ + +++ +++ Tr.4 +++ +++ +++ +++ + +++ +++ Tr.5 + +++ +++ ++ + +++ +++ Tr.6 +++ +++ +++ ++ + ++ +++ Tr.7 +++ +++ +++ ++ + +++ +++ Tr.8 ++ ++ +++ + + +++ +++ Tr.9 ++ ++ +++ +++ + +++ +++ Tr.10 + + + + + ++ +++
Ghi chú: (+) kháng yếu, đường kính nấm bệnh 26-40 mm; (++) kháng trung bình, đường kính nấm bệnh 11-
25 mm; (+++) kháng mạnh, đường kính nấm bệnh 0-10 mm
Đối với các chủng Trichoderma đã phân lập được, cả 10 chủng đều kháng lại vi nấm F. oxysporum với các mức độ khác nhau tùy vào từng chủng, 8/10 chủng có mức độ đối kháng vi nấm F. oxysporum nằm trong khoảng 50-78% và đặc biệt các chủng như Tr.2, Tr.4, Tr.7 thì mức độ đối kháng lên tới trên 90% tương tự với nghiên cứu của El-Komy và cộng sự (2015) [21]. Khả năng đối kháng với 2
nấm S. hydrophilum và N. dimidiatum tùy vào từng chủng sẽ cho mức độ đối kháng khác nhau. Theo kết quả nghiên cứu của Kotasthane Anil và các cộng sự (2015) về khả năng đối kháng của các chủng Trichoderma phân lập được với nấm S. rolfsii
cho kết quả về mức độ đối kháng nằm trong khoảng 49.5-81% [39]. Theo nghiên cứu của Jiang Heng và cộng sự (2007) về tương tác của nấm Trichoderma với nấm
P. capsici trong điều kiện in vitro cho thấy nấm Trichoderma có khả năng kháng và
ngăn chặn sự phát triển của nấm P. capsici [32]. Từ Bảng 4 có thể thấy kết quả đối kháng của các chủng Trichoderma phân lập được với vi nấm P. capsici rất khả quan, có 6/10 chủng có mức độ đối kháng trên 90%. Tuy nhiên, đối với nấm A. flavus tất cả các chủng Trichoderma phân lập được đều kháng lại nhưng với mức độ yếu không mạnh như với các nấm gây bệnh nêu trên, các chủng
Trichoderma chỉ tạo ra vòng kháng giữa ranh giới tiếp xúc của hai nấm và khơng có
hiện tượng nấm Trichoderma sinh trưởng bao trùm lên nấm A. flavus. Từ các kết
quả thu được có thể lựa chọn ra 3 chủng có khả năng đối kháng đa nấm với mức độ mạnh: Tr.2, Tr.4, Tr.7 để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Hình 8. Khả năng đối kháng của chủng Tr.2 với 7 lồi nấm gây bệnh cây trồng
Hình 9. Khả năng đối kháng của chủng Tr.7 với 7 loài nấm gây bệnh cây trồng
Chủng Tr.2, Tr.4 và Tr.7 có khả năng kháng nấm mạnh tiếp tục được kiểm tra khả năng khángCollectotrichum sp.gây bệnh trên ớt. Kết quả cho thấy, mức độ kháng của 3 chủng có khả năng đối kháng đạt hiệu quả tối đa 100% đối với chủng
Collectotrichum.
Tr. 2 Tr. 4 Tr. 7
Collectotrichum Collectotrichum Collectotrichum
Hình 10. Khả năng đối kháng của 3 chủng Trichoderma với Collectotrichum gây
3.1.3 Phân lập và sàng lọc các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm
Phân lập các chủng xạ khuẩn từ các mẫu rừng ngập mặn Cát Bà