Hình 8. Khả năng đối kháng của chủng Tr.2 với 7 lồi nấm gây bệnh cây trồng
Hình 9. Khả năng đối kháng của chủng Tr.7 với 7 loài nấm gây bệnh cây trồng
Chủng Tr.2, Tr.4 và Tr.7 có khả năng kháng nấm mạnh tiếp tục được kiểm tra khả năng khángCollectotrichum sp.gây bệnh trên ớt. Kết quả cho thấy, mức độ kháng của 3 chủng có khả năng đối kháng đạt hiệu quả tối đa 100% đối với chủng
Collectotrichum.
Tr. 2 Tr. 4 Tr. 7
Collectotrichum Collectotrichum Collectotrichum
Hình 10. Khả năng đối kháng của 3 chủng Trichoderma với Collectotrichum gây
3.1.3 Phân lập và sàng lọc các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm
Phân lập các chủng xạ khuẩn từ các mẫu rừng ngập mặn Cát Bà
Trong những năm gần đây, nhiều nhà khoa học trong nước cũng như trên thế giới đặc biệt lưu ý đến việc tìm kiếm các hợp chất sinh trưởng thứ cấp từ xạ khuẩn rừng ngập mặn. Bởi theo các nhà khoa học, chúng là nguồn sinh các chất có hoạt tính sinh học dồi dào, trong đó có chất kháng nấm. Thực tế, họ đã phát hiện nhiều hợp chất kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, kháng ung thư,… từ xạ khuẩn rừng ngập mặn với hoạt tính mạnh hơn rất nhiều so với xạ khuẩn từ đất liền [30]. Đây cũng là lí dó tại sao, chúng tơi lựa chọn tìm kiếm xạ khuẩn ở hệ sinh thái rừng ngập mặn. Kết quả từ 29 mẫu đất và trầm tích chúng tôi đã phân lập được tổng cộng 109 chủng xạ khuẩn. Các chủng xạ khuẩn được phân lập chủ yếu dựa trên sự khác biệt về màu sắc và hình dạng khuẩn lạc. Các chủng được phân lập được chia thành 7 nhóm dựa trên màu sắc khuẩn lạc: trắng, xám, đỏ, vàng, đen và cam. Các chủng có màu trắng và xám chiếm tỷ lệ lớn nhất, bề mặt khuẩn lạc thường xù xì, dạng phấn, khuẩn ti cơ chất phát triển mạnh với các chuỗi sinh bào tử dài, đây là các đặc điểm thuộc của chi Streptomyces. Đây là nhóm lớn nhất với 78 chủng trong số 109 chủng phân lập được với tỷ lệ 71%. Các chủng có khuẩn lạc màu vàng, đặc điểm của chi Micromonospora (khuẩn lạc nhỏ, rắn, chắc, hệ sợi khơng có bào tử) chiếm tỷ lệ 14% với 15 chủng. Như vậy Streptomyces và Micromonospora là các chi xạ khuẩn
chiếm ưu thế. Ngoài ra các chủng xạ chủng xạ khuẩn có màu sắc khuẩn lạc hiếm bao gồm màu da cam chiếm 9%, đen chiếm 2% và xanh 1% chiếm tỷ lệ thấp nhất Kết quả phân lập được các chủng xạ khuẩn với màu sắc đa dạng gợi ý rằng rừng ngập mặn Vườn quốc gia Cát bà có thể là một nguồn xạ khuẩn có tiếm năng lớn về sự đa dạng nhóm lồi.
Hình 11. Khuẩn lạc của một số chủng xạ khuẩn phân lập từ Rừng ngập mặn
Vườn Quốc gia Cát Bà.
Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm
Để tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm cao , trước tiên chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng kháng nấm N. dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên thanh long của tất cả các chủng xạ khuẩn bằng phương pháp khuếch tán trên thạch. Kết quả cho thấy, trong tổng số 109 chủng xạ khuẩn có 21 chủng thể hiện hoạt tính kháng nấm ở các mức độ khác nhau. Bốn chủng xạ khuẩn bao gồm S7, S19, S20, S21 có hoạt tính kháng nấm N. dimidiatum mạnh nhất. Tuy nhiên 3 chủng S9, S20, S7 sau 7 ngày đường kính vịng kháng nấm N. dimidiatum có xu hướng
giảm đáng kể.
Các chủng này tiếp tục được khảo sát khả năng kháng nấm với các chủng nấm kiểm định khác bao gồm A. niger, A. flavus, P. capsici, F. oxysporum, Sclerotium, P. digitatum. Kết quả cho thấy S7, S19, S20 có khả năng đối kháng yếu
P. digitatum và Collectotrichum . Duy nhất chỉ có chủng xạ khuẩn S21 có khả năng
đối kháng mạnh với các nấm gây hại trên và đồng thời đường kính vịng kháng nấm khơng thay đổi sau 19-22 ngày quan sát. Từ các kết quả thu được có thể lựa chọn chủng S21 có khả năng đối kháng đa nấm với mức độ mạnh để sử dụng cho các nghiên cứu chuyên sâu hơn.
Bảng 5. Khả năng kháng các loại nấm gây bệnh trên cây của 4 chủng xạ khuẩn
được tuyển chọn Chủng P . ca p sici F . o x ysp o rum Sclero tiu m s p . N. d im id ia tum A . nig er A . fla vus P . d ig ita tum C o llecto tr ich um S21 +++ +++ ++ +++ +++ ++ ++++ + S20 + + + ++++ ++ + ++ - S19 + + + +++ ++ + ++ - S7 + + + +++ + - ++ -
Hình 13. Khả năng kháng nấm của chủng xạ khuẩn S21 3.2 Phân loại các chủng đƣợc tuyển chọn
3.2.1 Phân loại các chủng vi khuẩn có hoạt tính kháng nấm mạnh Đặc điểm hình thái: Đặc điểm hình thái:
Để phân loại các chủng phân lập có khả năng kháng nhiều nấm, chúng tơi tiến hành quan sát hình dạng khuẩn lạc và nhuộm Gram các chủng, kết quả cho thấy khi tế bào 11 chủng được nhuộm Gram và quan sát dưới kính hiển vi cho thấy có 10 chủng là Gram dương, đều có dạng chuỗi, que và có nội bào tử, như vậy có thể sơ bộ kết luận rằng 10 chủng này thuộc chi Bacillus, chỉ riêng chủng LU4.4 là vi
Bảng 6. Hình thái khuẩn lạc, hình dạng vi khuẩn dưới kính hiển quang học(x100)
Kí hiệu Hình thái khuẩn lạc Kết quả nhuộm Gram Đặc điểm
N5
Chủng N5 có khuẩn lạc trịn, màu hơi đục, bề mặt nhăn; tế bào nhỏ, tách rời nhau. Tế bào dạng hình que, là vi khuẩn thuộc Gram dương
DH4.15
Hình dạng khuẩn lạc trịn, bóng với màu trắng, tế bào dạng chuỗi, que, thuộc Gram dương.
Phân loại các chủng vi khuẩn bằng sinh học phân tử
Các chủng với hoạt tính kháng đồng thời nhiều nấm được tiến hành phân loại đến loài dựa vào đặc điểm hình thái và giải trình tự gen 16S rRNA. Sản phẩm PCR thu được từ 11 chủng có kích thước khoảng 1500 bp được tinh sạch bằng kit tách chiết ADN của hãng Promega để đảm bảo chất lượng cho quá trình giải trình tự. Giải trình tự được thực hiện bởi cơng ty 1st Base (Singapore) với hai mồi là từ hai chiều độc lập nhau. Các trình tự ADN nhận được được phân tích bằng ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/) và Nucleotide BLAST của NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/). Các kết quả thu được sau khi sử dụng công cụ BLAST được chuyển vào phần mềm MEGA6 để tiến hành phân tích về chủng loại phát sinh.
Bảng 7. Kết quả định danh của 11 chủng vi khuẩn chọn lọc
Hầu hết các chủng đều thuộc chi Bacillus, trong đó các chủng N5, BNK8,
BNK2.3, BRK4.5, H2.7 thuộc loài B. subtilis, chủng DH4.9, DH4.15, BNK7.1,
H3.5, DT3.5 thuộc loài B. amyloliquefaciens. Riêng chủng LU4.4 là chủng Gram
âm, sau khi phân tích trình tự nhận thấy chủng LU4.4 thuộc chi Burkholderia, gần
gũi với loài Burkholderia vietnamienis với độ tương đồng về trình tự 16S rRNA là 99%.
Hình 14. Sản phẩm PCR đoạn 16S rRNA của ba chủng
Chủng Định danh N5 Bacillus subtilis BNK8 Bacillus subtilis BNK2.3 Bacillus subtilis DH4.9 Bacillus amyloliquefaciens DH4.15 Bacillus amyloliquefaciens
LU4.4 Burkholderia vietnamienis
BNK7.1 Bacillus amyloliquefaciens BRK4.5 Bacillus subtilis LTB2.7 Bacillus subtilis DH3.5 Bacillus amyloliquefaciens DT3.5 Bacillus amyloliquefaciens A B
3.2.2 Phân loại một số chủng Trichoderma
Các chủng Tr.2, Tr.4, Tr.7 đều có màu xanh đặc trưng, hệ sợi nấm lan rộng ra cả đĩa và tạo thành những vòng tròn đồng tâm trên bề mặt môi trường sau 4- 5 ngày ở nhiệt độ 25 - 30°C khi nuôi cấy trên môi trường PDA.
Hình 15. Hình thái khuẩn lạc và cuống bào tử của ba chủng Trichoderma
(A) Hình thái khuẩn lạc của 3 chủng Trichoderma trên môi trường PDA. (B) Cuống sinh bào tử nấm (khoanh tròn), bào tử nấm (mũi tên) dưới kính hiển vi phóng đại 400 lần.
Khi quan sát dưới kính hiển vi với mức độ phóng đại 400 lần cho tháy dạng sợi nấm, cuống sinh bào tử có cấu trúc phân nhánh và có hình chai mang đặc trưng của nấm Trichoderma. Bào tử có dạng hình cầu, hình trứng, ovan, bề mặt bào tử
trơn, nhẵn. Khi này mầm bào tử trương lên và hình thành sợi nấm.
Phân loại 3 chủng Trichoderma bằng sinh học phân tử
Các chủng Tr.2, Tr.4, Tr. 7 được lựa chọn để định danh bằng giải trình tự vùng ITS của rDNA. Kết quả tách ADN tổng số được điện di trên gel agarose 0.7% cho thấy chất lượng ADN đủ tốt để tiến hành phản ứng PCR khuếch đại vùng ITS
Tr. 7
Tr.2 Tr.4 Tr.7
A
của rDNA. Sản phẩm PCR từ 3 chủng Tr.2, Tr.4, Tr.7 thu được cho một băng duy nhất có kích thước khoảng 700 bp (Hình 22). Kết quả so sánh trình tự ITS thu được từ chủng Tr.2, Tr.4 và Tr.7 với dữ liệu trên GenBank cho thấy cả 3 chủng
Trichoderma đã lựa chọn đều có độ tương đồng cao với loài T. asperellum. Độ tương đồng của chủng Tr.2 ,Tr.4 và Tr.7 là 99%. Như vậy, dựa trên các đặc điểm về hình thái khuẩn lạc, hình dạng cuống sinh bào tử và dữ liệu giải trình tự vùng ITS của rDNA, chúng tôi thể kết luận rằng cả 3 chủng Tr.2, Tr.4, Tr.7 có hoạt tính kháng đa nấm gây bệnh cây trồng đều thuộc lồi T. asperellum.
Hình 16. ADN tổng số và sản phẩm PCR vùng ITS của 3 chủng Trichoderma
(A) ADN tổng số của 3 chủng Tr.2, Tr.4, Tr.7. (B) Kết quả PCR vùng ITS của 3 chủng Tr.2, Tri4, Tri7.
3.2.3 Quan sát đặc điểm hình thái của chủng xạ khuẩn S21
Chúng tôi tiến hành quan sát, kiểm tra các đặc điểm sinh học và phân loại chủng của chủng xạ khuẩn S21. Chủng này thuộc 2 nhóm màu khác nhau là nhóm trắng và nhóm xám. Chủng S21 hình thành khuẩn lạc màu trắng sau 4 ngày nuôi cấy, sau 6 ngày xuất hiện bào tử trắng mọc kín khuẩn lạc, sau 7 ngày thì bắt đầu chuyển dần sang màu xám nhạt đến đậm dần. Chủng này có kích thước nhỏ với đường kính khuẩn lạc từ 1-2 mm, khơng sinh sắc tố melani.
Hình 17. Hình thái khuẩn lạc và hình thái cuống sinh bào tử của chủng S21
trên môi trường nuôi cấy ở 30o
C, sau 3 ngày tuổi (A), sau 7 ngày tuổi (B) và cuống sinh bào tử (C)
3.3 Khả năng phân giải cơ chất của các chủng vi sinh vật tuyển chọn
Các vi sinh vật trong các chế phẩm thường có khả năng tiết các enzyme ngoại bào để phân hủy các chất cặn bã, việc phân giải các hợp chất dư thừa ở trong đất có thể hỗ trợ cho sinh trưởng ở cây. Do vậy, các chủng có hoạt tính kháng nấm mạnh và có khả năng nhiều nấm khác nhau gồm 8 chủng đã xác định được là: N5, DH4.15, Tr.2, Tr.4, Tr.7, S7, S20, S21 sẽ được tiến hành khảo sát khả năng tiết enzyme ngoại bào như amylase, cellulase, protease, chitinnase trên các đĩa mơi trường có bổ sung cơ chất thích hợp.
Hầu hết các chủng nghiên cứu đều có khả năng phân giải casein, chitin, tinh bột, cellulose mạnh với đường kính vịng phân giải lớn. Riêng khả năng sinh enzyme phytase thấp, 3 chủng gồm B. subtilis N5, B. amyloliquefaciens DH4.15, và
T. asperellum Tr.4 có khả năng tiết enzyme phytase nhưng bán kính vịng phân giải
chỉ 4 mm. Các chủng xạ khuẩn S20, S7, S19 đều tiết enzyme phân giải casein, chitin, cellulose rất mạnh, trong đó chủng S20 có đường kính vịng phân giải lớn nhất.
Bảng 8. Khả năng sinh enzyme phân giải cơ chất của các chủng có hoạt tính
kháng nấm mạnh.
Đƣờng kính vịng phân giải (D-d) mm
Protease Chitinase Amylase Cellulase Phytase
DH4.9 17 16 9 11 2 DH4.15 18 16 10 12 4 N5 20 18 10 12 4 Tr.2 20 12 5 20 4 Tr.4 19 5 0 20 0 Tr.7 19 6 0 19 0 S21 15 16 13 0 0 S20 22 27 26 32 0 S7 20 20 18 30 0 S19 19 23 0 12 0
Hình 18. Hoạt tính phân giải cơ chất của các chủng được tuyển chọn
Trên thế giới hiện nay cũng đã có nhiều nghiên cứu về khả năng phân giải các nhiều cơ chất của các loài như vi khuẩn B. amyloliquefaciens, T. asperellum
và Streptomyces. Các loài này được biết đến từ rất sớm nhờ khả năng sản sinh các
Chitinase Amylase Cellulase Phytase Protease S7 S20 S21 S7 S20 S21 S7 S20 S21 S7 S20 S21 Tr.2 Tr.4 Tr.7 Tr.2 Tr.4 Tr.7 Tr.2 Tr.4 Tr.7 Tr.2 Tr.4 Tr.7 Tr.2 N5 DH4.15 DH4.9 N5 DH4.15 DH4.9 N5 DH4.15 DH4.9 N5 DH4.15 DH4.9 N5 DH4.15 DH4.9
loại ezyme ngoại bào đa dạng như amylase, cellulase, protease. Enzyme do chúng tiết ra có nhiều đặc tính q như khả năng hoạt động tốt trong giải pH rộng và khả năng bền nhiệt. Bên cạnh đó, nhóm Bacillus, Trichoderma sống nội sinh vùng rễ cây có khả năng sinh phytase. Phytase là một enzyme xúc tác phản ứng thủy phân acid phytic thành myo-inositol và một số gốc photphat vơ cơ tự do, nhờ đó cây có thể dễ dàng hấp thu photphat vơ cơ trong đất [6].
Từ các kết quả trên có thể thấy chủng B. subtilis N5, chủng T. asperellum
Tr.4 và xạ khuẩn S21 có những hoạt tính rất hữu ích, khơng những có khả năng kháng nhiều nấm , mà cịn kích thích sinh trưởng ở cây nhờ khả năng phân giải nhiều hợp chất cao phân tử thành những phân tử nhỏ giúp cây dễ dàng hấp thụ. Nghiên cứu tiếp theo sẽ phát triển, sử dụng 3 chủng này trong sản xuất chế phẩm phân bón hữu cơ sinh học đảm bảo an toàn khi sử dụng và phù hợp với điều kiện canh tác ở Việt Nam.
3.4 Nghiên cứu sản xuất chế phẩm Bacillus – Trichoderma - Streptomyces trong
quy mơ phịng thí nghiệm.
3.4.1 Chế phẩm sinh học từ chủng B. subtilis N5
3.4.1.1 Xác định thông số lên men phù hợp của chủng B. subtilis N5
Khả năng sinh trưởng của B. subtilis N5 được khảo sát lần lượt các yếu tố tác động như thành phần môi trường, nhiệt độ, pH và thời điểm thu mẫu… Sinh khối của vi khuẩn được đánh giá dựa vào phương pháp đếm khuẩn lạc . Kết thúc quá trình khảo sát, các điều kiện được tối ưu sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. Lựa chọn mơi trường nhân sinh khối và thời gian thu mẫu
Vi sinh vật ln có khả năng sử dụng các nguồn dinh dưỡng khác nhau để duy trì hoạt động sống của chúng. Các chất dinh dưỡng được vi sinh vật hấp thụ và sử dụng làm nguyên liệu cung cấp cho quá trình trao đổi chất và tổng hợp các thành phần của tế bào. Năm môi trường khác nhau (King B, NB, SX1, SX3, SX2) đã được sử dụng để lựa chọn môi trường phù hợp nhất thông qua đánh giá khả năng sinh trưởng của chủng B. subtilis N5. Trong đó, mơi trường NB và King B là mơi trường
dinh dưỡng tổng hợp thường được biết đến trong nghiên cứu vi khuẩn thuộc nhóm
Bacillus. Các mơi trường cịn lại được thiết lập theo Schlegel, trong đó trên cơ sở
thay nguồn cacbon và nguồn đạm bằng nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm phù hợp với sản xuất ở quy mơ lớn. Trong đó, nước mắm, bột đậu tương, rỉ đường được sử dụng làm nguồn cacbon và nguồn đạm. Các môi trường sau khi lên men được thu thập xác định số lượng tế bào tại 24, 36, 48, 96 giờ, kết quả được trình bày hình 20.
Hình 19. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng và phát triển
của chủng B. subtilis (x108).
Cụ thể trong các môi trường này, mật độ tế bào của chúng đều đạt cực đại sau 1 ngày nuôi cấy, tùy theo chủng, giá trị thấp nhất là 1,4x109 CFU/ml trong môi trường SX1. Kết quả đếm mật độ tế bào thu tại các thời điểm 24 giờ cho thấy mật độ tế bào ở môi trường NB và SX3 nhiều hơn các môi trường khác. Môi trường NB được sử dụng nguồn nguyên liệu là cao thịt với giá thành cao. Bởi vậy để tiết kiệm và đơn giản trong sản xuất, môi trường SX3 đã được thay thế nguồn dinh dưỡng chuẩn để sử dụng trong nuôi cấy nhân sinh khối vi khuẩn B. subtilis, cũng như có các thành phần cơ bản thích hợp cho tế bào tăng sinh khối. Do đó, việc lựa chọn môi trường SX3 cho nghiên cứu sản xuất là phù hợp. Từ kết quả trên, chúng tôi chọn môi trường SX3 và thời gian nuôi cấy 24 giờ để khảo sát các thí nghiệm tiếp theo. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 24 48 72 96 King B SX1 NB SX2 SX3
Thời gian nuôi cấy (giờ)