Xác định điều kiện lên men B.megaterium VACC 118 thích hợp

CHƢƠNG III : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Xác định điều kiện lên men thích hợp cho chủng Bacillus megaterium

3.1.1. Xác định điều kiện lên men B.megaterium VACC 118 thích hợp

3.1.1.1. Đánh giá ảnh hƣởng của môi trƣờng và thời gian lên men đến quá

trình sinh trƣởng của B.megaterium VACC 118

Trong sản xuất công nghiệp, môi trường lên men tốt giúp đảm bảo đủ dưỡng chất cần thiết cho vi sinh vật sinh trưởng, phát triển tốt. Dù King B là loại mơi trường thích hợp cho quá trình sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn sinh IAA [8], song thành phần của môi trường này tương đối phức tạp, hầu hết thuộc loại hóa chất phải nhập khẩu, rất đắt tiền nên không thể áp dụng trong sản xuất cơng nghiệp nên q trình lựa chọn mơi trường phù hợp để sản xuất quy mô lớn là hết sức cần thiết.

Trong thí nghiệm này, mơi trường King B cùng với hai loại môi trường dùng trong lên men sản xuất thu dịch vi sinh là môi trường nước chiết đậu và SX BA đã được sử dụng. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến mật độ tế bào cũng được khảo sát và kết quả được trình bày trên Bảng 7.

Bảng 7. Ảnh hưởng của môi trường và thời gian lên men đến quá trình sinh trưởng và

phát triển của B.megaterium VACC 118

Môi trƣờng lên men Thời gian lên men

(giờ) King B (CFU/ml) Chiết đậu (CFU/ml) SX BA (CFU/ml) 0 giờ (2,90±0,45) x104 (4,00±0,34) x104 (2,80±0,44) x 104 48 giờ (2,00±0,30) x108 (3,70±0,25) x 108 (1,20±0,38) x 108 72 giờ (2,60±0,22) x107 (5,30±0,22) x 107 (2,40±0,33) x 107

Số liệu tại Bảng 7 cho thấy, chủng vi khuẩn B.megaterium VACC 118 sinh trưởng và phát triển tốt nhất trên môi trường nước chiết đậu, mật độ tế bào trong

dịch lên men đạt mức cao hơn so với hai mơi trường cịn lại với 3.70 x 108 CFU/ml

dịch lên men sau 48h nuôi. Kết quả khảo sát cũng chỉ ra rằng, thời gian ni lý tưởng là 48h vì tại đây mức sinh khối VSV đạt cao nhất và có thể quần thể VSV đang ở pha cân bằng. Khi thời gian nuôi tăng lên 72h, nồng độ VSV bị giảm rõ rệt, chứng tỏ VSV lên men đã chuyển qua pha suy vong.

Trên cơ sở kết quả thu được, có thể nhận xét rằng chủng B.megaterium

VACC 118 phát triển tốt nhất trên môi trường nước chiết đậu, và thời gian nuôi

cấy 48h được áp dụng như điều kiện tiên quyết để thực hiện tiếp các khảo sát điều kiện lên men của B.megaterium VACC 118.

3.1.1.2. Đánh giá ảnh hƣởng của pH mơi trƣờng đến q trình sinh trƣởng của B.megaterium VACC 118.

pH của môi trường ni cấy vi sinh vật có ý nghĩa quyết định đối với sự sinh trưởng của vi sinh vật. Các ion H+ và OH- là hai ion hoạt động lớn nhất trong tất cả các ion. Những biến đổi về nồng độ của chúng dù nhỏ cũng ảnh hưởng đến quá trình hấp thu, trao đổi chất của vi sinh vật [53]. Trong thí nghiệm này, sinh trưởng và phát triển của chủng vi khuẩn sinh IAA được khảo sát trên môi trường nước chiết đậu ở các pH khác nhau, kết quả được trình bày trong Bảng 8.

Bảng 8. Ảnh hưởng của pH và thời gian lên men đến quá trình sinh trưởng và phát

triển của B.megaterium VACC 118.

pH môi trƣờng Thời gian pH 6,0 (CFU/ml) pH6,5 (CFU/ml) pH7,0 (CFU/ml) pH7,5 (CFU/ml) 48 giờ (3,80±0,25) x 10 7 (9,10±0,20) x 107 (7,50±0,21) x 108 (3,70±0,26) x 108 72 giờ (2,60±0,11) x 10 6 (4,70±0,28) x 107 (2,90±0,18) x 107 (2,50±0,18) x 107

Kết quả Bảng 8 cho thấy: vùng pH mơi trường thích hợp nhất cho

B.megaterium VACC 118 phát triển là 7,0, tại pH môi trường này chủng vi khuẩn

nghiên cứu đạt mật độ tế bào cao khoảng 7.50 x 108 CFU/ml dịch lên men. Cũng

như các khảo sát bên trên thì sau 72h tại các pH khác nhau nhưng mật độ tế bào VSV cũng có xu hướng giảm so với tại thời điểm 48h.

Từ kết quả thu được Bảng 8 chúng tôi sử dụng pH môi trường lên men là 7,0 – là môi trường cho hiệu quả sinh trưởng B.megaterium tốt nhất, để tiếp tục tiến hành nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men

3.1.1.3. Đánh giá ảnh hƣởng của nhiệt độ môi trƣờng lên men đến quá trình sinh trƣởng của B.megaterium VACC 118.

Để chọn ra nhiệt độ môi trường lên men tối ưu, chúng tôi khảo sát dải nhiệt độ từ 25°C đến 35°C. Các yếu tố khác của q trình lên men giữ khơng thay đổi bao gồm: mơi trường lên men là môi trường nước chiết đậu, pH mơi trường = 7.0, tốc độ sục khí 0.75 lít khơng khí /lít mơi trường/phút, tốc độ cánh khuấy 300 vòng/phút, tỷ lệ cấp giống cấp I là 3,0 %, thời gian lên men: 48 giờ. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng và phát triển của các chủng vi sinh vật được trình bày ở Bảng 9.

Bảng 9. Ảnh hưởng của nhiệt độ mơi trường lên q trình sinh trưởng và

phát triển của các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp IAA

Nhiệt độ môi trƣờng (oC) 25 oC 30oC 35oC Mật độ (CFU/ml) (1,30±0,25) x 10 8 (5,20±0,18) x 108 (5,40±0,12) x 107

Từ kết quả thu được Bảng 9 cho thấy. Chủng B.megaterium VACC 118 phát triển trong toàn bộ dải nhiệt độ đã khảo sát, tuy nhiên 30°C là nhiệt độ thích hợp nhất cho quá trình lên men thu sinh khối của chủng vi khuẩn nghiên cứu.

Từ kết quả này, nhóm nghiên cứu sử dụng nhiệt độ lên men ở 30°C để tiếp tục đánh giá các thông số lên men còn lại.

3.1.1.4. Đánh giá ảnh hƣởng của lƣu lƣợng cấp khí và tốc độ khuấy lên men đến quá trình sinh trƣởng của B.megaterium VACC 118

Để chọn ra nhiệt độ môi trường lên men hiệu quả, chúng tơi khảo sát dải cấp khí cho lên men từ 0.55-0.85 lít thơng khí/lít mơi trường/phút. Các yếu tố khác của q trình lên men giữ khơng thay đổi bao gồm: môi trường lên men là môi trường nước chiết đậu, pH môi trường = 7.0, tốc độ cánh khuấy 300 vòng/phút, tỉ lệ cấp giống cấp I là 3,0 %, thời gian lên men: 48 giờ. Sau khi thực nghiệm, kết quả đánh giá ảnh hưởng của lưu lượng khơng khí cấp đến sinh trưởng và phát triển của các chủng vi sinh vật được trình bày ở Bảng 10.

Bảng 10. Ảnh hưởng của lượng khí cấp đến q trình sinh trưởng và phát triển của

các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp IAA

Lƣợng khí cấp (lít khơng khí/lít MT/phút) Mật độ tế bào (CFU/ml) 0,55 (2,4±0,25)x106 0,65 (1,5±0,12)x108 0,75 (5,3±0,17)x108 0,85 (2,5±0,25)x108

Kết quả cho thấy khi lượng khơng khí cung cấp trong quá trình lên men ảnh hưởng rất nhiều tới hiệu quả lên men VSV. Khi lượng cấp khí quá thấp (khoảng 0,55 lít thơng khí/ lít mơi trường/ phút), cũng đồng nghĩa với lượng oxy hòa tan trong bể lên men ở mức thấp, sẽ khiến cho hiệu quả lên men giảm sút đáng kể, chỉ đạt 2,4×106

CFU/ml dịch ni sau 48h lên men. Khi lượng cấp khí đạt 0,75 lít khơng khí/mơi trường/phút thì khả năng sinh trưởng, phát triển của chủng nghiên cứu cao nhất với đạt 5,3×108 CFU/ml dịch nuôi sau 48h lên men. Tuy nhiên, khi lượng cấp khí trong mơi trường tăng lên tới 0.85 lít khơng khí/mơi trường/phút thì tốc độ lên men của chủng B.megaterium khảo sát bị giảm. Điều này có thể giải thích là do khi lượng cấp khí tăng cao hơn nhu cầu, sẽ làm môi trường bị xáo trộn quá

nhiều, gây ảnh hưởng tới hoạt động hấp thụ dinh dưỡng của đối tượng nghiên cứu dẫn tới giảm hiệu suất lên men.

Từ kết quả nghiên cứu này, chúng tôi chọn lưu lượng khí cấp 0,75 lít

khơng khí/mơi trường/phút để tiếp tục nghiên cứu các thơng số lên men tiếp theo

Ngoài lưu lượng cấp khí, tốc độ cánh khuấy ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Ngồi tác dụng hồ đều lượng ơxy vào mơi trường, q trình khuấy trộn giúp các tế bào vi sinh vật có thể chuyển động, tạo điều kiện cho chúng có thể hấp thụ chất dinh dưỡng một cách dễ dàng. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của tốc độ cánh khuấy đến sự gia tăng sinh khối của

B.megaterium VACC 118 được trình bày trong Bảng 11.

Bảng 11. Ảnh hưởng tốc độ cánh khuấy đến quá trình sinh trưởng và phát triển

của các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp IAA

Vận tốc cánh khuấy (vòng/phút) Mật độ tế bào (CFU/ml) 250 (1,8±0,33)x107 300 (4,8±0,24)x108 350 (3,2±0,28)x108 400 (2,6±0,35)x108

Như chỉ ra trên Bảng 11, mật độ tế bào của chủng vi khuẩn khảo sát đạt cao nhất khi tốc độ cánh khuấy trong q trình lên men là 300 vịng/phút, mật độ tế bào vi khuẩn đạt 4,8x108 CFU/ml. Tại các mức độ tốc độ khuấy thấp hơn hoặc nhanh hơn hiệu quả lên men đều khơng cao, điều này có thể do tốc độ khuấy chậm sẽ hạn

chế khả năng hồ tan O2 trong khơng khí vào mơi trường làm giảm hiệu quả hô hấp

tế bào, tuy nhiên tốc độ khuấy quá cao sẽ cản trở vi sinh vật hấp thụ chất dinh dưỡng của VSV.

Từ kết quả nghiên cứu này, chúng tôi chọn tốc độ cánh khuấy trong quá trình lên men là 300 vịng/phút để tiếp tục nghiên cứu các thông số lên men tiếp theo

3.1.1.5. Đánh giá ảnh hƣởng của tỉ lệ tiếp giống đến quá trình sinh trƣởng của B.megaterium VACC 118.

Trong kỹ thuật lên men hiện đại, ngoài các yếu tố về môi trường dinh dưỡng, điều kiện nuôi cấy thì lượng giống cấp 1 bổ sung vào quá trình lên men hết sức quan trọng, nó quyết định chất lượng và giá thành của sản phẩm. Nghiên cứu đưa ra một tỷ lệ giống cấp 1 thích hợp trong q trình lên men là rất cần thiết. Sau khi khảo sát, kết quả đánh giá ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấp 1 đến sinh trưởng và phát triển của các chủng vi sinh vật được trình bày ở Bảng 12.

Bảng 12. Ảnh hưởng tỷ lệ giống cấp 1 đến quá trình sinh trưởng và phát triển của

các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp IAA

Nồng độ giống cấp 1 (%) 3% 5% 7% Mật độ tế bào (CFU/ml) (6,30±0,25) x 10 8 (7,65±0,22) x 108 (6,90±0,38) x 108

Kết quả Bảng 12 cho thấy, khi lượng giống cấp 1 bổ sung vào là 3% thì mật

độ tế bào trong dịch lên men đều đạt trên 108 CFU/ml. Tuy nhiên, khi bổ sung 5%

hoặc 7% mật độ tế bào đạt được cao hơn không nhiều so với khi bổ sung 3%. Kết quả trên cho thấy, để tiết kiệm chi phí sản xuất thì lượng giống cấp I được bổ sung vào 3% là thích hợp nhất cho quá trình lên men các chủng vi khuẩn nghiên cứu.

Kết luận: Sau các thí nghiệm để tối ưu để lên men B. megaterium VACC

118, chúng tơi đã lựa chọn được một quy trình tối ưu như sau: mơi trường lên men phù hợp là nước chiết đậu pH = 7,0, tỷ lệ cấp giống cấp 1 là 3%, nhiệt độ môi

trường lên men (tº = 30°C), lượng khí cấp 0,75 lít khơng khí/lít mơi trường/phút, tốc độ cánh khuấy 300 vòng/phút, thời gian lên men 48 giờ.

3.1.2. Đánh giá chất lƣợng phân bón vi sinh dạng hạt

Phân vi sinh vật dạng hạt chứa các bào tử B.megaterium đã được tạo ra theo quy trình mơ tả trong Hình 2 và chất lượng sản phẩm phân bón được đánh giá thơng qua các chỉ tiêu kỹ thuật như trình bày trong Bảng 13. Rõ ràng là, phân bón vi sinh vật dạng hạt được tạo ra đáp ứng toàn bộ các yêu cầu hiện hành về pH, độ ẩm, mật độ tế bào và độ tạp nhiễm. Đặc biệt là mật độ tế bào VSV hữu ích trong phân bón

VSV dạng hạt đạt 4,341010 CFU/g, cao hơn nhiều so với quy định hiện hành (chỉ

yêu cầu trên 108

CFU/g).

Hình 4. Hạt phân bón được tạo ra từ thiết bị tạo hạt và thành phẩm sau khi sấy khô Mật độ vi sinh vật cao giúp tăng thời gian bảo quản. Hơn nữa, độ ẩm thấp của của các hạt phân bón giúp hạn chế tạp nhiễm và kéo dài thời gian bảo quản. So với các nghiên cứu trước, thì mật độ B.megaterium trong phân bón của chúng tơi

tương đối giống với mật độ của A.brasillense (1010-1011 CFU/g) trong phân bón dạng hạt bao bởi alginate – tinh bột theo nghiên cứu của Ivanova et al [29], tuy nhiên kết quả của chúng tôi lại cao hơn nhiều so với nghiên cứu tương tự của

Nguyễn Thu Hà và cộng sự khi mật độ tế bào chỉ đạt 8,6×108 CFU/g [2]. Điều tạo

nên sự khác biệt về mật độ VSV này chính là do sự khác biệt trong chất mang sử dụng để bao gói VSV.

Bảng 13. Chất lượng của phân vi sinh vật dạng hạt

Chỉ tiêu kỹ thuật Kết quả đo Nghị định 108/2017/NĐ-CP

Độ ẩm (%) 9,4  30

pH 5,7  5

Mật độ tế bào (CFU/g) 4,34  1010  108

Salmonella (CFU/25g) Không phát hiện Không phát hiện

E.coli (CFU/g) Không phát hiện  103

Tinh bột biến tính có khả năng tan tốt trong nước và giảm các liên kết hydro nội phân tử , nhờ vậy các phân tử tinh bột này có thể dễ dàng phân tán trong dung dịch tạo hạt [1]. Bên cạnh đó, chiếu xạ gama làm tăng tính keo của tinh bột biến tính. Kết quả là hạt phân bón có một cấu trúc đồng nhất và có khối lượng chất khơ

cao hơn, nhờ vậy B.megaterium có thể tồn tại và phát triển tốt hơn trong hạt phân

bón sử dụng tổ hợp alginate – tinh bột biến tính hơn là tổ hợp alginate – tinh bột thông thường.

Bảng 14. Ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến mật độ tế bào trong hạt phân bón Thời gian ngâm

(ngày) Tỉ lệ trương (%) Lượng tế bào giải phóng (CFU/ml)

1 57.0 7,2107

2  1,15108

7  4,2108

Nhìn vào Bảng 14, ta thấy, tỉ lệ trương của hạt phân bón đạt 57% tương đương sự tăng kích thước gấp 1,57 lần chỉ sau 24 giờ ngâm nước. Không chỉ khối lượng của hạt phân bón sau ngâm tăng lên mà cả đường kính của hạt cũng tăng lên do hấp thu nước, nhờ vậy VSV có thể dễ dàng giải phóng ra khỏi hạt. Trong ngày đầu tiên, lượng tế bào giải phóng là 7,2×107 CFU/ml. Lượng tế bào giải phóng ra tiếp tục tăng lên tới 1,15×108 CFU/ml trong ngày thứ hai và đạt 4,2×108 CFU/ml

sau một tuần ngâm. Kết quả này gợi ý rằng vi khuẩn không hề bị cố định trong chất mang, mà chúng có thể di chuyển dễ dàng vào rễ sau khi được bón vào đất. Trên thực tế, tốc độ giải phóng của VSV sống vào trong đất chậm hơn nhiều do các hạt phân bón khơ cần phải có thời gian thu đủ ẩm và trương nở.

Nghiên cứu về thời hạn sử dụng của phân bón, ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến mật độ tế bào VSV sống trong hạt và hoạt lực của chúng cũng được khảo sát theo thời gian và kết quả được trình bày trong Bảng 15.

Bảng 15. Tỉ lệ sống sót của B.megaterium trong hạt phân bón sau thời gian bảo quản

Thời gian bảo quản (ngày) Mật độ tế bào (CFU/g)

0 4,34  1010

7 4,26  1010

30 4,18  1010

90 3,75  1010

180 2,31  1010

Như chỉ ra trên Bảng 15, mật độ tế bào VSV gần như không thay đổi trong thời gian đầu của quá trình bảo quản. Sau 6 tháng bảo quản ở điều kiện phịng thí nghiệm, mật độ tế bào B. megaterium giảm không đáng kể từ 4,34 1010 CFU/g xuống còn 2,311010 CFU/g. Sự suy giảm này là thấp hơn so với nghiên cứu của

Nguyễn Thu Hà và CS [2] cho thấy mật độ vi khuẩn B.megaterium giảm từ 8,6108

xuống cịn 2,6108 CFU/g. Sự khác biệt này có thể là do chế phẩm phân bón của họ

chứa 4 chủng VSV và được tạo ra trên nền chất mang gồm tinh bột sắn và cám gạo mà không được tạo hạt bảo quản. Nghiên cứu của Thirumal và CS cũng cho thấy mật độ tế bào VSV trong chất mang nguồn gốc alginate giảm không đáng kể trong 3 tháng đầu bảo quản. Số lượng tế bào VSV trong phân bón từ chất mang sodium

alginate tuy có giảm song vẫn duy trì ở mức trên 7108CFU/g sau 8 tháng bảo quản

[56]. Điều này gợi ý rằng chất mang dạng hạt khâu mạch giữa sodium alginate và calcium chlorua có thể cho phép các tế bào VSV nói chung và các Bacillus nói

3.2. Đánh giá hiệu quả phân bón trên cây rau

Hình 5. Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của phân vi sinh đến cây cải bắp, cà chua và cải củ. (A) Khảo nghiệm đồng ruộng của cây bắp cải, (B) Khảo nghiệm đồng ruộng của cây cà chua, (C) Khảo nghiệm đồng ruộng của cây cải củ.

Nghiên cứu về ảnh hưởng của phân vi sinh đến sự sinh trưởng và phát triển của cây cải bắp, cà chua và cải củ (Hình 5) cho thấy cây rau được chăm sóc bằng