CHƢƠNG 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp phân tích tài liệu thứ cấp
Phương pháp này sử dụng để phân tích các nguồn tài liệu có liên quan đến vấn đề nghiên cứu. Các nguồn tài liệu chính thức bao gồm kết quả các cơng trình nghiên cứu trong và ngồi nước; Các nguồn sách báo, tạp chí; Các tài liệu, kỷ yếu hội thảo khoa học,…Các nguồn tài liệu trên sẽ được sử dụng như một cơ sở khoa học tin cậy. Ngoài ra đề tài sẽ khảo sát thực địa khu vực nghiên cứu nhằm tạo ra sự liên kết chặt chẽ giữa lý thuyết và thực tế.
2.4.2. Phương pháp khảo sát, lấy mẫu đồng ruộng và bố trí thực nghiệm
- Thu thập tất cả các loại triệu chứng bệnh hại trên tất cả các bộ phận của cây liên quan đến bệnh nấm phấn trắng trên cây đậu tương và dưa chuột.
- Các mẫu bệnh được đựng trong các túi xi măng, giấy báo để trong hộp xốp lạnh. Sau khi thu thập được gửi hoặc mang ngay về phịng thí nghiệm để giám định.
- Cần ghi rõ các thông tin của mẫu:
+ Ngày, địa điểm thu mẫu, tên của chủ ruộng lấy mẫu.
+ Cây trồng (giống, tuổi cây, lịch sử của cây, những cây trồng cùng) + Bộ phận cây bị hại
+ Đất đai (đất đỏ, đất đồi, đồng bằng, thung lũng…), quản lý (phân bón, thuốc trừ sâu bệnh, vệ sinh đồng ruộng…)
2.4.3. Phương pháp thực nghiệm trong phịng thí nghiệm
2.4.3.1. Đánh giá khả năng đối kháng của xạ khuẩn có ích đến tác nhân gây bệnh phấn trắng trên dưa chuột và đậu tương trong phịng thí nghiệm
Thu thập mẫu bệnh phấn trắng trên đồng ruộng mang về phòng đánh giá hiệu quả phịng trừ trong phịng thí nghiệm (Theo phương pháp của Yukio Sato, Trường Đại học Toyama, Nhật Bản)
Sử dụng băng dính nhỏ màu trắng trong, cắt thành từng miếng nhỏ dài x rộng = 2cm x 1 cm, lấy miếng băng dính đã cắt nhỏ dính lên đám nấm trên bề mặt vết bệnh. Sau đó nhỏ một giọt nước lên lam, đặt miếng băng dính đã dính nấm lên trên giọt nước, đậy la men lên trên. Quan sát hình thái của bào tử vơ tính, giác bám, cành bào tử phân sinh trước và sau thí nghiệm.
Phương pháp đặc điểm hình thái của ống mầm: lấy một củ hành tây thật tươi, bóc tách thành từng lớp của củ hành, cắt thành những miếng có kích thước 1,5cm x 1,5 cm, dùng dao cấy tách lấy lớp màng phía trong của miếng hành. Pha cồn 700 cho vào một lọ nhỏ có nút đậy, thả lớp màng của củ hành ngâm trong cồn đã pha, để 1 tuần là có thể dùng được. Dùng panh gắp miếng màng của củ hành đặt lên bề mặt vết bệnh, chọn vết bệnh có nhiều bột bào tử, thả nhẹ lên bề mặt hộp petri có chứa nước. Theo dõi khả năng nảy mầm và hình thái ống mầm bào tử sau 1 ngày, 2 ngày, 3 ngày.
2.4.3.2. Nghiên cứu chế phẩm sinh học
Nghiên cứu và sản xuất chế phẩm sinh học xạ khuẩn đối kháng theo phương pháp của Tiến sĩ Kyung Seok Park, 2003, Viện NIAST, Hàn Quốc, Khoa Bệnh cây, trường Đại Học Chung Hsing, Đài Loan và phương pháp trong Phân bón của tập 3 tiêu chuẩn phân bón, tuyển tập phân bón tiêu chuẩn nơng nghiệp Việt Nam, 2001.
* Nghiên cứu chế phẩm dạng lỏng
- Nghiên cứu thành phần và tỷ lệ phối trộn cơ chất của môi trường nhân sinh khối.
Cơng thức thí nghiệm:
CT1: Nền + Bột đậu tương 30g/l CT2: Nền + Bột đậu tương 60g/l CT3: Nền + Bột đậu tương 90g/l CT4: Nền + Bột đậu tương 120g/l
Nền: Rỉ đường (10g/l) + bột men ép (5g/l), CaC03 (1g/l) Chỉ tiêu theo dõi: Số khuẩn lạc/ml
+ Ảnh hưởng của các loại môi trường đến khả năng nhân sinh khối của xạ
khuẩn streptomyces SM19 trong môi trường dạng lỏng trong sản xuất chế phẩm.
Cơng thức thí nghiệm:
CT1: Rỉ đường (10g/l) + bột men ép (5g/l), CaC03 (1g/l) + bột đậu tương 90g/l
CT2: Rỉ đường (10g/l) + bột men ép (5g/l), CaC03 (1g/l) + bột ngô 90g/l CT3: Mơi trường PSA lỏng + nước mắm (1 thìa/lít)
CT4: Môi trường king B lỏng Chỉ tiêu theo dõi: Số khuẩn lạc/ml
- Nghiên cứu xác định các thông số kỹ thuật tối ưu trong lên men nhân sinh khối
(pH, nhiệt độ, số vòng lắc, thời gian nhân sinh khối)
+ Ảnh hưởng của tần số vòng lắc đến sự phát triển của xạ khuẩn đối kháng: Cơng thức thí nghiệm:
CT1: Đối chứng không lắc CT2: Lắc chế phẩm ở 100 rpm CT3: Lắc chế phẩm ở 120 rpm CT4: Lắc chế phẩm ở 140 rpm Chỉ tiêu theo dõi: Số khuẩn lạc/ml
+ Ảnh hưởng của thời gian lắc đến sự phát triển của xạ khuẩn đối kháng:
Cơng thức thí nghiệm:
CT1: Lắc chế phẩm ở 120 rpm trong 2 ngày CT2: Lắc chế phẩm ở 120 rpm trong 3 ngày CT3: Lắc chế phẩm ở 120 rpm trong 4 ngày
CT4: Lắc chế phẩm ở 120 rpm trong 5 ngày CT5: Lắc chế phẩm ở 120 rpm trong 6 ngày Chỉ tiêu theo dõi: Số khuẩn lạc/ml
+ Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của xạ khuẩn đối kháng:
Cơng thức thí nghiệm:
CT1: Lắc chế phẩm ở 120 rpm ở 25°C CT2: Lắc chế phẩm ở 120 rpm ở 30°C CT3: Lắc chế phẩm ở 120 rpm ở 34°C Chỉ tiêu theo dõi: Số khuẩn lạc/ml
- Ảnh hưởng của độ pH đến sự phát triển của xạ khuẩn đối kháng: Công thức thí nghiệm: pH = 5, 6, 7, 8
Chỉ tiêu theo dõi: số khuẩn lạc/ml
* Nghiên cứu chế phẩm dạng bán xốp
- Nghiên cứu thành phần và tỷ lệ phối trộn cơ chất của môi trường nhân sinh khối.
+ Ảnh hưởng của các loại môi trường đến khả năng nhân sinh khối của xạ khuẩn
streptomyces SM19 trong môi trường dạng bán xốp trong sản xuất chế phẩm:
Cơng thức thí nghiệm
1. Mơi trường gạo (250g gạo + 150ml nước)
2. Môi trường bột ngô (250g bột ngô + 150ml nước) 3. Môi trường cám (250 g cám + 100 ml nước) 4. Mơi trường thóc (200g thóc + 250ml nước)
2.4.4. Nghiên cứu phương pháp bảo quản sản phẩm đã nhân sinh khối xạ khuẩn
Gồm 2 công thức:
CT1: Sản phẩm được bảo quản sau 1 tháng CT2: Sản phẩm được bảo quản sau 3 tháng CT3: Sản phẩm được bảo quản sau 6 tháng
2.4.5. Đánh giá khả năng phòng trừ bệnh của chế phẩm trong điều kiện nhà lưới
Ươm tạo các loại cây trồng chính (cây đậu tương, hoa hồng,dưa chuột, mướp đắng...) trong điều kiện nhà lưới để lây bệnh nhân tạo. Sử dụng bút lông quét bào tử nấm chuyển từ lá bệnh sang cây định lây nhiễm, đặt ở điều kiện nhiệt độ 220C và độ ẩm >90% (phun sương).
Theo dõi thời gian tiềm dục, tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh (%) của cây sau lây nhiễm.
+ Thí nghiệm tìm hiểu nồng độ chế phẩm trong phịng trừ bệnh
Bố trí thí nghiệm với 4 công thức tương ứng với bốn mức nồng độ khác nhau (CFU/ml). Phương pháp tiến hành: cây được trồng thành ơ nhỏ trong điều kiện nhà lưới, bố trí thí nghiệm theo khối ngẫu nhiên, nhắc lại 3 lần, ô 1,5 m2
/mỗi lần nhắc. Chỉ tiêu theo dõi: TLB (%) và CSB (%).
2.4.6. Đánh giá hiệu quả của chế phẩm trong phòng trừ bệnh trên đồng ruộng
Các thí nghiệm đối với bệnh phấn trắng ở vườn ươm, ngoài đồng và lây nhiễm nhân tạo VSV gây bệnh theo phương pháp nghiên cứu BVTV ở quyển I, II, III ấn hành 1997, 1998 của Viện BVTV; tiêu chuẩn Bảo vệ thực vật tập I, II của tuyển tập Tiêu chuẩn nông nghiệp Việt Nam và Phân bón của tập III, Tiêu chuẩn Phân bón, tuyển tập phân bón tiêu chuẩn Nơng nghiệp Việt Nam, 2001.
- Thí nghiệm diện hẹp bố trí theo khối ngẫu nhiên tuần tự, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, 2 - 3m2/ lần nhắc (Cây đậu tương và dưa chuột) và 20 cây/lần nhắc.
- Thí nghiệm diện rộng khơng nhắc lại, mỗi công thức 200 m2(Cây đậu tương và cây dưa chuột), theo dõi 5 điểm theo đường chéo góc, số cây theo dõi 5-10 cây/điểm. Mỗi công thức 100 cây, Điều tra theo 5 điểm đường cheo mỗi điểm 2 cây, mỗi cây điều tra theo 4 hướng, mỗi hướng 1 cành.
- Xác định nồng độ, liều lượng, của chế phẩm chứa xạ khuẩn đối với bệnh phấn trắng trên dưa chuột và trên đậu tương trong thí nghiệm diện hẹp
+ Chế phẩm xạ khuẩn đối kháng: Gồm 5 cơng thức/thí nghiệm và (2 cây là đậu tương, dưa chuột) = 2 thí nghiệm.
1. Phun với nồng độ 2,5% 2. Phun với nồng độ 5% 3. Phun với nồng độ 7,5%
4. Phun với nồng độ 10% 5. Đối chứng (Phun nước lã)
- Xác định thời điểm xử lý của chế phẩm đối với bệnh phấn trắng trên dưa
chuột và trên đậu tương trong thí nghiệm diện rộng (Trên cây dưa chuột và đậu tương)
Cơng thức thí nghiệm:
1. Phun phịng khi bệnh chưa xuất hiện
2. Phun khi bệnh bắt đầu xuất hiện (CSB<3%) 3. Phun khi bệnh có chỉ số bệnh > 5%
- Đánh giá hiệu lực của nồng độ chế phẩm đơn dòng xạ khuẩn ở diện rộng (Trên cây dưa chuột, đậu tương). Cơng thức thí nghiệm:
1. Phun với nồng độ 5% 2. Phun với nồng độ 10% 3. Đối chứng (Phun nước lã)
- Đánh giá hiệu lực của số lần xử lý chế phẩm xạ khuẩn đơn dòng (Trên cây dưa chuột, đậu tương). Cơng thức thí nghiệm
1. Phun 1 lần với nồng độ 10% 2. Phun kép 2 lần cách nhau 7 ngày 3. Phun kép 2 lần cách nhau 14 ngày
- Đánh giá hiệu lực của phun kép xạ khuẩn đơn dòng ở diện rộng cách nhau 7 – 14 ngày ( đậu tương). Cơng thức thí nghiệm:
1. Phun kép 2 lần cách nhau 7 ngày với nồng độ 10% của 2 dòng vi khuẩn và xạ khuẩn đối kháng
2. Phun kép 2 lần cách nhau 14 ngày với nồng độ 10% của 2 dòng vi khuẩn và xạ khuẩn đối kháng
3. Đối chứng (Phun nước lã)
2.5. Phƣơng pháp tính tốn và xử lý số liệu
2.5.1. Phương pháp tính tốn
TLB(%) =
B A
x 100
Trong đó: A là tổng số cây bị bệnh, B là tổng số cây thí nghiệm - Chỉ số bệnh: CSB(%) = n k v ni i ( ) x 100
Trong đó: (ni x vi) là tổng của tích số cây bị bệnh với trị số cấp bệnh tương ứng, k là trị số cấp bệnh cao nhất, n là tổng số cây theo dõi.
- Tính trị số cấp bệnh ( Điều tra theo phương pháp của viện BVTV. Tác giả: Đặng Vũ Thị Thanh, Hà Minh Trung, 1997).
- Cấp 1: < 5 % diện tích lá có vết bệnh - Cấp 2: 5 – 10 % diện tích lá có vết bệnh - Cấp 3: 10– 15 % diện tích lá có vết bệnh - Cấp 4: 15 – 20 % diện tích lá có vết bệnh - Cấp 5: > 20 % diện tích lá có vết bệnh
- Tính hiệu quả phịng trừ theo cơng thức (Hederson –Tilton):
HQPT(%) = (1- ) x 100
Trong đó : Tb : CSB(%) ở cơng thức thuốc trước xử lý
Ta : CSB(%) ở công thức thuốc sau xử lý
Cb : CSB(%) ở công thức đối chứng trước xử lý Ca : CSB(%) ở công thức đối chứng sau xử lý.
- Xử lý số liệu theo chương trình SAT 9.1 PORTABLE FOR WINDOW
2.5.2. Phương pháp xử lý số liệu
- Kết quả được phân tích thống kê dùng ANOVA và test Duncan với mức ý
nghĩa P= 0.05, sử dụng phần mềm IRRISTAR 5.0
- Số liệu cũng được xử lý thống kê bằng EXCEL
Ta x Cb
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả nghiên cứu khả năng đối kháng của xạ khuẩn SM19 đối với nấm phấn trắng gây hại đậu tƣơng và dƣa chuột trong phịng thí nghiệm nấm phấn trắng gây hại đậu tƣơng và dƣa chuột trong phịng thí nghiệm
3.1.1. Xạ khuẩn đối với nấm phấn trắng gây hại đậu tương
Đánh giá khả năng đối kháng của các xạ khuẩn bằng chất kháng sinh ức chế nấm phấn trắng gây hại cho cây đậu tương, chúng tôi thu thập mẫu phấn trắng trên cây bị bệnh ngoài đồng ruộng, sau đó chọn dịng xạ khuẩn SM19 để tiến hành thí nghiệm đánh giá khả năng ức chế của các dòng xạ khuẩn này đối với nấm phấn trắng. Nấm phấn trắng trên đồng ruộng gây hại theo cơ chế bào tử nấm nảy mầm tạo thành vòi hút, xâm nhiễm vào mơ cây qua lỗ khí khổng, xạ khuẩn sản sinh chất kháng sinh ức chế khả năng nảy mầm của bào tử, do vậy sẽ hạn chế được sự phát triển của nấm bệnh tấn công gây hại cây. Theo dõi khả năng nảy mầm của bào tử nấm phấn trắng trên môi trường màng vỏ củ hành tây được đặt trong dung dịch có chứa xạ khuẩn. Kết quả trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Hiệu quả phòng trừ của dòng xạ khuẩn đối kháng SM19 đối với nấm phấn trắng trên cây đậu tương
Liều lƣợng (cfu/ml) Đối chứng SM19 Kích thƣớc chiều dài ơng mầm (mm) Tỷ lệ nảy mầm (%) Kích thƣớc chiều dài ơng mầm (mm) Tỷ lệ nảy mầm (%) 104 36 59 24 38 105 36 59 19 26 106 36 59 12 18 107 36 59 0 0 108 36 59 0 0
Ghi chú: thời gian theo dõi sau thí nghiệm 9 giờ
Nấm phấn trắng là ký sinh chun tính khơng sống trên mơi trường nhân tạo, vi vậy chúng tôi sử dụng môi trường màng vỏ củ hành tây để nuôi cấy nấm phấn trắng. Nấm bệnh trên môi trường vỏ của củ hành tây trong công thức đối chứng là
nước cất thi bào tử nấm phấn trắng vẫn nảy mầm bình thường (59% bào tử nảy mầm), trong công thức với liều lượng 104 – 106 cfu/ml cho tỷ lệ nảy mầm thấp hơn (18 – 38%), 107 – 108 cfu/ml bào tử không nảy mầm. Nhiều tài liệu cũng cho thấy một số dịng xạ khuẩn có khả năng tiết ra chất kháng sinh ức chế được sự phát triển của nấm bệnh. mặc dù không tiếp xúc trực tiếp với nấm bệnh.
3.1.2. Xạ khuẩn đối với nấm phấn trắng gây hại dưa chuột
Đánh giá khả năng đối kháng của các xạ khuẩn bằng chất kháng sinh ức chế nấm phấn trắng gây hại cho cây dưa chuột, chúng tôi thu thập mẫu phấn trắng bị bệnh trên đồng ruộng, sau đó cũng chọn dịng xạ khuẩn SM19 tiềm năng để tiến hành thí nghiệm đánh giá khả năng ức chế của các dòng xạ khuẩn này đối với nấm phấn trắng. Theo dõi khả năng nảy mầm của bào tử nấm phấn trắng trên môi trường màng vỏ củ hành tây. Kết quả trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Hiệu quả phòng trừ của dòng xạ khuẩn đối kháng SM19 đối với nấm phấn trắng trên cây dưa chuột
Liều lƣợng (cfu/ml) Đối chứng SM19 Kích thƣớc chiêù dài ống mầm (µm) sau 8h Tỷ lệ nảy mầm (%) Kích thƣớc chiều dài ơng mầm (mm) Tỷ lệ nảy mầm (%) 104 32 84 26 48 105 32 84 18 36 106 32 84 12 12 107 32 84 0 0 108 32 84 0 0
Ghi chú: Thời gian theo dõi sau thí nghiệm 9 giờ
Nấm bệnh trên môi trường vỏ của củ hành tây trong công thức đối chứng là nước cất thi bào tử nấm phấn trắng vẫn nảy mầm đạt cao (84% bào tử nảy mầm), trong công thức với liều lượng 104
– 106 cfu/ml cho tỷ lệ nảy mầm thấp hơn (12 – 48%), 107 – 108 cfu/ml bào tử không nảy mầm. Nhiều tài liệu cũng cho thấy một số dịng xạ khuẩn có khả năng tiết ra chất kháng sinh ức chế được sự phát triển của nấm bệnh. mặc dù không tiếp xúc trực tiếp với nấm bệnh.
3.2. Kết quả nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học xạ khuẩn
Streptomyces SM19
Trước khi tiến hành nghiên cứu sản xuất chế phẩm xạ khuẩn, chúng tôi tiến hành nhân nuôi nguồn gốc xạ khuẩn SM19. Nguồn xạ khuẩn SM19 là kết quả nghiên cứu của đề tài nghị đinh thư giữa Việt Nam và Nhật Bản do Viện bảo vệ thực vật chủ trì.
3.2.1. Nghiên cứu chế phẩm dạng lỏng
3.2.1.1. Nghiên cứu thành phần và tỷ lệ phối trộn cơ chất của môi trường nhân sinh khối xạ khuẩn SM19 để sản xuất chế phẩm dạng lỏng
- Nghiên cứu ảnh hưởng của lượng bột đậu trong môi trường nhân sinh khối
Nghiên cứu môi trường lỏng để nhân sinh khối xạ khuẩn đối kháng đã được tuyển chọn để đưa vào sản xuất chế phẩm cấp 2, chúng tôi chọn nghiên cứu thử nghiệm bột đậu tương kết hợp với chất phụ gia để nhân nuôi xạ khuẩn đối kháng. Kết quả thu được ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của lượng bột đậu trong môi trường nhân nuôi đến khả năng nhân sinh khối của xạ khuẩn SM19
TT Cơng thức thí nghiệm Số khuẩn lạc/ml