CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2. Kết quả nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học xạ khuẩn Streptomyces
3.2.1. Nghiên cứu chế phẩm dạng lỏng
3.2.1.1. Nghiên cứu thành phần và tỷ lệ phối trộn cơ chất của môi trường nhân sinh khối xạ khuẩn SM19 để sản xuất chế phẩm dạng lỏng
- Nghiên cứu ảnh hưởng của lượng bột đậu trong môi trường nhân sinh khối
Nghiên cứu môi trường lỏng để nhân sinh khối xạ khuẩn đối kháng đã được tuyển chọn để đưa vào sản xuất chế phẩm cấp 2, chúng tôi chọn nghiên cứu thử nghiệm bột đậu tương kết hợp với chất phụ gia để nhân nuôi xạ khuẩn đối kháng. Kết quả thu được ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của lượng bột đậu trong môi trường nhân nuôi đến khả năng nhân sinh khối của xạ khuẩn SM19
TT Cơng thức thí nghiệm Số khuẩn lạc/ml
(CFU/ml) 1 Nền + Bột đậu tương 30g/l 3,3 x 108 a 2 Nền + Bột đậu tương 60g/l 7,5 x 108 a 3 Nền + Bột đậu tương 90g/l 23,6 x 108 c 4 Nền + Bột đậu tương 120g/l 13,5 x 108 b CV(%) 24,0
(Nền: Rỉ đường (10g/l) + bột men ép (5g/l) + CaC03 (1g/l))
Ghi chú: - Các chữ khác nhau a, b, c, d trong cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05.
- CV: Độ biến động của thí nghiệm (%)
Bột đậu tương là mơi trường giàu dinh dưỡng khi kết hợp với chất phụ gia thích hợp cho sự phát triển của xạ khuẩn đối kháng SM19. Kết quả ở bảng 3.1 cho
(23,6 x 108 cfu/ml); Ở liều lượng tăng 120g/l nhưng số khuẩn lạc khơng tăng mà lại giảm, có thể do mơi trường đặc q khơng có khơng gian cho xạ khuẩn có điều kiện phát triển; Ở mức 30 – 60g/l bột đậu cho mật độ xạ khuẩn trên môi trường mọc kém nhất (3,3 – 7,5 x 108
cfu/ml), do môi trường dinh dưỡng thấp hơn. Chọn liều lượng bột đậu tương 90g/l kết hợp với môi trường nền Rỉ đường (10g/l) + bột men ép (5g/l) + CaC03 (1g/l) để tiến hành nhân sinh khối xạ khuẩn SM19.
3.2.1.2. Xác định môi trường dạng lỏng nhân ni thích hợp cho xạ khuẩn đối kháng (SM19)
Để xác định môi trường nhân ni thích hợp cho xạ khuẩn đối kháng đã tuyển chọn, chúng tôi tiến hành thử nghiệm 4 loại môi trường khác nhau để nhân sinh khối xạ khuẩn đối kháng, theo dõi số khuẩn lạc mọc trên môi trường, kết quả thu được ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của các loại môi trường dạng lỏng nhân nuôi đến khả năng nhân sinh khối của xạ khuẩn SM19
TT Cơng thức thí nghiệm Số khuẩn lạc/ml
(cfu/ml)
1 Rỉ đường (10g/l) + bột men ép (5g/l), CaC03 (1g/l)
+ bột đậu tương 90g/ l 24,6 x 10
8 c
2 Rỉ đường (10g/l) + bột men ép (5g/l), CaC03 (1g/l)
+ bột ngô 90g/ l 17,5 x 10
8 b
3 Môi trường PSA lỏng + nước mắm (1 thìa/lít) 10,5 x 108 a
4 Môi trường king B lỏng 6,9 x 108 a
CV(%) 15,4
Ghi chú: - Các chữ khác nhau a, b, c, d trong cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05.
- CV: Độ biến động của thí nghiệm (%)
Kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của các loại môi trường nhân nuôi dạng lỏng cho thấy môi trường Rỉ đường (10g/l) + bột men ép (5g/l) + CaC03 (1g/l) + Bột đậu tương (90g/ l) thích hợp nhất cho sự phát triển của xạ khuẩn trong việc sản xuất
chế phẩm dạng lỏng, mật độ xạ khuẩn đạt cao nhất là 24,6 x 108 cfu/ml. Sau đó đến mơi trường rỉ đường (10g/l) + bột men ép (5g/l) + CaC03 (1g/l) + bột ngô (90g/l), mật độ xạ khuẩn đạt 17,5 x 108 cfu/ml. Hai môi trường PSA lỏng và King B lỏng phát triển kém nhất, mật độ xạ khuẩn đạt 6,9 - 10,5 x 108
cfu/ml.
3.2.1.3.Nghiên cứu xác định các thông số kỹ thuật tối ưu trong lên men nhân sinh khối của xạ khuẩn SM19 để sản xuất chế phẩm dạng lỏng
Các kết quả nghiên cứu trong mục 3.2.1.2 đã cho thấy bột đậu tương với
lượng 90g/l trong môi trường nền Rỉ đường (10g/l) + bột men ép (5g/l), CaC03 (1g/l) để nhân nuôi xạ khuẩn SM19. Tiếp theo để xác định các thông số tối ưu trong lên men nhân sinh khối tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của tần số vòng lắc, thời gian lắc cũng như nhiệt độ và pH thích hợp với sự phát triển của xạ khuẩn SM19 trong môi trường nhân sinh khối.
* Ảnh hƣởng của tần số vòng lắc đến sự phát triển của xạ khuẩn
Nhiều nghiên cứu về sản xuất sinh khối xạ khuẩn đối kháng cho thấy kỹ thuật lắc cũng kích thích khả năng nhân sinh khối nhanh trên môi trường lỏng, để xác định khả năng lắc có ảnh hưởng đến sự phát triển của xạ khuẩn đối kháng đã được tuyển chọn hay không, chúng tơi tiến hành thí nghiệm với 4 cơng thức, theo dõi số khuẩn lạc phát triển trên môi trường, kết quả ghi nhận ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của tần số vòng lắc đến sự phát triển của xạ khuẩn SM19 trong môi trường nhân sinh khối
TT Cơng thức thí nghiệm Số khuẩn lạc/ml
(cfu/ml) 1 Đối chứng không lắc 3,1 x 107 a 2 Lắc chế phẩm ở 100 rpm 22,7 x 108 b 3 Lắc chế phẩm ở 120 rpm 42,0 x 108 c 4 Lắc chế phẩm ở 140 rpm 31,1 x 108 b CV(%) 21,8
Ghi chú: - Các chữ khác nhau a, b, c, d trong cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05.
Kết quả cho thấy chế độ lắc ảnh hưởng lớn đến khả năng nhân sinh khối của xạ khuẩn đối kháng trong môi trường lỏng, không lắc cho mật độ khuẩn lạc thấp hơn nhiều so với chế độ lắc, số khuẩn lạc chỉ đạt 3,1 x 107
cfu/ml. Chế độ lắc ở 120 rpm cho mật độ khuẩn lạc đạt cao nhất là 42,0 x 108 cfu/ml.
Hình 3.1. Ảnh hưởng của tần số vòng lắc đến khả năng nhân sinh khối của xạ khuẩn SM19
* Ảnh hƣởng của thời gian lắc đến sự phát triển của xạ khuẩn đối kháng
Để xác định thời gian lắc tối ưu cho xạ khuẩn phát triển trên mơi trường lỏng thích hợp, chúng tơi tiến hành nghiên cứu lắc ở các thời gian khác nhau, sau đó cấy lại trên mơi trường để theo dõi số khuẩn lạc mọc, kết quả ghi nhận ở bảng 3.6.
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của thời gian lắc đến sự phát triển của xạ khuẩn SM19 trong mơi trường nhân sinh khối
TT Cơng thức thí nghiệm Số khuẩn lạc/ml
(cfu/ml) 1 Lắc chế phẩm ở 120 rpm trong 2 ngày 2,5 x 108 a 2 Lắc chế phẩm ở 120 rpm trong 3 ngày 7,5 x 108 b 3 Lắc chế phẩm ở 120 rpm trong 4 ngày 14,4 x 108 c 4 Lắc chế phẩm ở 120 rpm trong 5 ngày 42,8 x 108 d 5 Lắc chế phẩm ở 120 rpm trong 6 ngày 41,8 x 108 d CV(%) 11,9
Ghi chú: - Các chữ khác nhau a, b, c, d trong cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05.
Sau 2 ngày lắc ở 120 rpm, xạ khuẩn đối kháng SM19 đã phát triển trong môi trường nhân sinh khối đạt 2,5 x 108
cfu/ml, số khuẩn lạc tăng dần theo thời gian, thời gian tối ưu cho xạ khuẩn phát triển là 5 ngày, đạt số khuẩn lạc cao nhất 42,8 x 108 cfu/ml, sau đó tiếp tục lắc thì mật độ xạ khuẩn khơng tăng thêm.
Hình 3.2. Ảnh hưởng của thời gian lắc đến sự phát triển của xạ khuẩn SM19 trong môi trường nhân sinh khối
* Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng phát triển của xạ khuẩn đối kháng
Nhiều vi sinh vật chịu tác động mạnh của điều kiện ngoại cảnh đến sự phát triển của chúng, đặc biệt là yếu tố nhiệt độ môi trường. Chúng tôi nghiên cứu xác định mức nhiệt độ tối ưu để cho xạ khuẩn phát triển nhanh trong môi trường nhân sinh khối. Thí nghiệm được tiến hành nhân nuôi chế phẩm ở 5 điều kiện nhiệt độ khác nhau, kết quả ghi nhận ở bảng 3.7.
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của xạ khuẩn SM19 trên môi trường nhân sinh khối
TT Cơng thức thí nghiệm Số khuẩn lạc/ml
(cfu/ml) 1 Lắc chế phẩm ở 120 rpm ở 26°C 22,0 x 108 a 2 Lắc chế phẩm ở 120 rpm ở 28°C 44,8 x 108 c 3 Lắc chế phẩm ở 120 rpm ở 30°C 43,1 x 108 c 4 Lắc chế phẩm ở 120 rpm ở 32°C 35,0 x 108 b 5 Lắc chế phẩm ở 120 rpm ở 34°C 26,3 x 108 a CV(%) 9,5
Ghi chú: - Các chữ khác nhau a, b, c, d trong cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa với
P ≤ 0,05.
- CV: Độ biến động của thí nghiệm (%)
Kết quả cho thấy xạ khuẩn có thể phát triển tốt ở phạm vi nhiệt độ rộng, ở tất cả các điều kiện nhiệt độ nghiên cứu xạ khuẩn đều phát triển tốt, tuy nhiên mức nhiệt độ tối ưu nhất cho xạ khuẩn SM19 phát triển là 28 – 300
C ở chế độ lắc 120 rpm. Các mức nhiệt độ khác cho số khuẩn lạc thấp hơn đạt từ 22,0 – 26,3 x 108
cfu/ml.
* Ảnh hƣởng của pH đến sự phát triển của xạ khuẩn đối kháng (SM19)
Nghiên cứu mức pH thích hợp cho xạ khuẩn phát triển trong môi trường nhân sinh khối, chúng tơi tiến hành thí nghiệm với 4 mức pH khác nhau 5, 6, 7, 8, theo dõi sự phát triển của khuẩn lạc trên môi trường kết quả ghi nhận ở bảng 3.8.
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của độ pH đến sự phát triển của xạ khuẩn SM19 trên môi trường nhân sinh khối
TT Cơng thức thí nghiệm Số khuẩn lạc/ml
(cfu/ml) 1 pH = 5 2,6 x 108 a 2 pH = 6 20,8 x 108 c 3 pH = 7 39,8 x 108 d 4 pH = 8 13,1 x 108 b CV(%) 15,7
Ghi chú: - Các chữ khác nhau a, b, c, d trong cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05.
- CV: Độ biến động của thí nghiệm (%)
Kết quả cho thấy xạ khuẩn phát triển ở phạm vi pH rộng trong môi trường nhân sinh khối. Mức pH thích hợp nhất cho xạ khuẩn phát triển là pH = 7, cho số lượng khuẩn lạc trên môi trường đạt cao nhất ( 39,8 x 108
cfu/ml), ở mức cao pH = 8, xạ khuẩn vẫn phát triển nhưng kém hơn, số khuẩn lạc đạt 13,1 x 108 cfu/ml, ở mức pH = 5 xạ khuẩn phát triển kém nhất, số khuẩn lạc đạt 2,6 x 108 cfu/ml.