CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN
1.6. Phƣơng pháp xác định vi khuẩn A baumannii kháng carbapenem
1.6.1. Phương pháp nuôi cấy, phân lập vi khuẩn
Hiện nay nuôi cấy, phân lập vi khuẩn A. baumannii thường sử dụng các môi trường như thạch máu, Sô cô la, thạch thường, MacConkey.
1.6.2. Các phương pháp xác định vi khuẩn A. baumannii kháng carbapenem
Phương pháp định danh vi khuẩn A. baumannii
a, Định danh bằng phƣơng pháp API 20NE: API 20 NE là một hệ thống
chuẩn để định danh những trực khuẩn ngoài đường ruột, và các Gram (-) dễ thích ứng ( ví dụ: Pseudomonas, Acinetobacter, Flavobacterium, Moraxella, Vibrio, Aeromonas,
vv...) kết hợp giữa 8 test thường quy, 12 test đồng hóa và một cơ sở dữ liệu.
b, Định danh bằng máy tự động Vitek2-compact
Dùng phương pháp đo màu để nhận biết các tính chất sinh vật hố học của vi sinh vật thông qua sự thay đổi màu của các giếng mơi trường có sẵn trong card định danh. Phần mềm so sánh kết quả thu được với cơ sở dữ liệu để đưa ra kết quả.
c, Định danh bằng máy Phonex
Phương pháp xác định vi khuẩn A. baumannii kháng carbapenem
a, Phƣơng pháp kháng sinh đồ bằng khoanh giấy khuếch tán
Khoanh giấy có đường kính và độ dày nhất định, vô trùng, đã tẩm sẵn KS với nồng độ nhất định (dựa vào hiệu lực của từng KS) được đặt lên đĩa môi trường đã nuôi cấy vi khuẩn (theo hướng dẫn CLSI 2017) [39].
b, Kỹ thuật kháng sinh đồ bằng E-test:
Kháng sinh đồ định lượng xác định MIC bằng E-test là KS được tẩm trong thanh E-test sẽ khuếch tán vào trong môi trường thạch và ức chế sự phát triển của vi khuẩn (theo hướng dẫn CLSI 2017) [39].
Xác định mức độ KKS bằng máy tự động VITEK 2 – Compact dựa trên nguyên lý: hệ thống quang học sử dụng ánh sáng nhìn thấy để theo dõi trực tiếp sự phát triển của vi sinh vật thông qua việc đo cường độ ánh sáng bị chặn lại (hay sự suy giảm cường độ ánh sáng) khi ánh sáng đi qua giếng; Dùng phương pháp đo độ đục của vi khuẩn bằng việc sử dụng card kháng sinh đồ để xác định MIC - nồng độ ức chế tối thiểu, bằng máy Vitek 2 – compact.
Những kỹ thuật trên địi hỏi nhân lực, chi phí tốn kém và kéo dài thời gian trả kết quả làm ảnh hưởng đến việc điều trị cho bệnh nhân.
Phương pháp nuôi cấy, phân lập sử dụng môi trường sàng lọc CHROMagarTMmSuperCARBATM và định danh VK bằng máy MALDI Biotyper là phương pháp đơn giản, dễ làm, dễ thực hiện, ít tốn kém và hiệu quả cao. Kết quả định danh nhanh chóng, chính xác và sàng lọc được vi khuẩn kháng carbapenem ngay từ khi nuôi cấy mà không cần phải làm kỹ thuật kháng sinh đồ.
CHROMagarTMmSuperCARBATM của hãng CHROMagar là môi trường được thiết kế riêng cho việc phân lập vi khuẩn kháng carbapenem. Hai nhà nghiên cứu Alain Rambach và Patrice Nordmann đã cùng nhau nỗ lực phát triển ra một mơi trường tạo màu có độ nhạy cao là CHROMagarTMmSuperCARBATM, thế hệ mới của môi trường tạo màu đạt được các kết quả chưa từng có như phát hiện một loạt lớn các carbapenemases KPC, NDM, VIM, IMP, OXA. Nghiên cứu của tác giả Sergio García-Fernández và cộng sự, năm 2016 đã chỉ ra giới hạn phát hiện lên tới 10CFU/ml, ngay cả đối với carbapenemase yếu như OXA-48 trong khi vẫn duy trì mức chọn lọc cao [101]. Mơi trường CHROMagar Acinetobacter có độ nhạy cao là 86,5% và độ đặc hiệu là 75%. Phương pháp này có thể hữu ích nhất trong việc kiểm sốt dịch bệnh và trong các tình huống đặc hữu [40].
Định danh vi khuẩn bằng máy MALDI Biotyper
Nguyên lý: Mỗi loài sinh vật đều có thành phần các protein trong ribosome
rất đặc trưng cho riêng lồi đó, gọi là dấu ấn phân tử (molecular fingerprint) của lồi. Máy MALDI Biotyper sử dụng cơng nghệ MALDI-TOF MS để gây ion hóa và thu nhận các protein/peptide từ mẫu cần định danh, sau đó biểu diễn chúng ở dạng
một phổ khối lượng (hay còn gọi là khối phổ - mass spectrum). Bằng cách so sánh khối phổ thu được với các phổ tham chiếu có sẵn trong thư viện dữ liệu, máy MALDI Biotyper sẽ cho kết quả định danh chính xác lồi vi sinh vật.
ƯU ĐIỂM VƯỢT TRỘI CỦA MALDI BIOTYPER
- Độ chính xác cực kỳ cao: Định danh bằng công nghệ MALDI-TOF MS, tiếp cận các ribosomal protein đặc trưng có trong tế bào vi sinh vật để định danh chính xác lồi đó. Theo kiểm nghiệm của cơ quan FDA (Mỹ), máy MALDI Biotyper cho kết quả định danh chính xác tương đương phương pháp giải trình tự, với độ tương đồng về kết quả lên đến trên 99.2 %.
- Thời gian định danh rất nhanh: Cho kết quả chỉ trong vòng vài giây. Tiết kiệm được ít nhất 24-48 giờ so với các phương pháp sinh hóa truyền thống. - Định danh đa chủng vi sinh vật: Thư viện hiện tại có 7311 chủng (năm
2017), bao gồm hầu hết các loài thường gặp trong lâm sàng và các loài trong thực phẩm, thú y, dược phẩm... Dữ liệu được cập nhật hàng năm.
- Thao tác vô cùng đơn giản: Cho khuẩn lạc (hoặc dịch mẫu) lên đĩa kim loại, thêm hóa chất matrix rồi cho vào máy định danh để có kết quả ngay.
- Kết quả định danh không phụ thuộc vào các điều kiện nuôi cấy mẫu: chỉ cần có mẫu khuẩn lạc là có thể định danh bằng MALDI Biotyper ngay, khơng quan trọng mẫu khuẩn lạc đó được ni cấy trên mơi trường gì, nhiệt độ - Tiết kiệm chi phí: mỗi mẫu định danh chỉ cần dùng 1 µL hóa chất HCCA
matrix mà khơng tốn thêm hóa chất nào khác, giá thành hóa chất thấp.
- Khơng cần bảo trì bảo dưỡng hằng ngày. Có thể kết nối với hệ thống Quản lý thông tin của đơn vị.
Gần đây phương pháp MALDI-TOF đã nổi lên như một công cụ tiềm năng để xác định và chẩn đốn VK. Trong q trình MALDI-TOF, VK được xác định bằng cách sử dụng các tế bào nguyên vẹn hoặc chiết xuất từ tế bào, q trình này nhanh chóng, nhạy cảm và kinh tế cả về lao động và chi phí liên quan. Cơng nghệ này được các nhà vi sinh học báo cáo về việc sử dụng MALDI-TOF cho một số mục đích như xác định VK, nghiên cứu dịch tễ học, phát hiện tác nhân chiến tranh
sinh học, phát hiện mầm bệnh từ nước, thực phẩm, KKS và mầm bệnh từ đường máu, đường tiết niệu…để chẩn đoán các bệnh do VK, virus và nấm gây ra [83].
Theo một nghiên cứu của tác giả M. Marí-Almirall năm 2017, cho thấy 78 chủng Acinetobacter được định danh bằng máy MALDI-TOF đã xác định thành
công tất cả các chủng sử dụng quang phổ từ khuẩn lạc với độ tin cậy cao 99,6%. Việc sử dụng phần mềm dữ liệu sau xử lý đã xác định các lồi cụ thể có ý nghĩa thống kê, nhận dạng chính xác nhanh chóng các lồi trong nhóm Acinetobacter [72]. Nghiên cứu năm 2014, hiệu quả của phép đo khối phổ MALDI-TOF đã xác định chính xác 98,6% (142/144) các chủng A. baumannii, 72,4% (63/87) các chủng A. nosocomialis, 97,6% (41/42) các chủng A. pittii [92]. Một nghiên cứu khác ở Ý, năm 2012, phương pháp MALDI-TOF MS có thể được sử dụng thành cơng trong vi sinh lâm sàng thông thường cho xác định thời gian thực của sự bùng phát ở BV từ VK A. baumannii được phân lập trước khi kết quả từ các hệ thống phân tích DNA được tận dụng [30]. Nghiên cứu của tác giả AdelaÁlvarez-Buylla năm 2012, trong tổng số 109 chủng Acinetobacter được xác định bằng MALDI-TOF MS, phát hiện được 87 chủng A. baumannii. 31 chủng trong số này được thử nghiệm bằng việc
giải trình tự gen thì kết quả giải trình tự cho thấy 16 kết quả phù hợp với phép đo phổ. Mặc dù MALDI-TOF có thể hữu ích xác định A. baumannii nhưng khơng phải các lồi khác trong chi này [57]. Một nghiên cứu ở Pháp và Angeria (2013) ứng dụng phương pháp MALDI-TOF để xác định các chủng VK K. pneumoniae nhằm điều tra dịch tễ học. MALDI-TOF đã được tìm thấy là một cơng cụ đầy hứa hẹn để xác định và phân biệt giữa các chủng K. pneumoniae theo đặc tính kiểu hình và phân bố dịch tễ học của chúng [78].