CHƢƠNG 2 : ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.3. Các kỹ thuật nghiên cứu
2.4.3.1. Chuẩn bị môi trường CHROMagarTMmSuperCARBATM
- Môi trường chọn lọc của hãng CHRomagar.
- Môi trường sinh màu phát hiện và phân lập Carbapenemase
Chuẩn bị:
Bước 1:
+ Hịa tan 42,5 g bột khơ trong 1 L nước cất
+ Thêm 2 ml chất bổ sung S1 CHROMagarTMmSuperCARBATM vào huyền phù
+ Khuấy đều cho đến khi agar nở ra
+ Gia nhiệt và đun sôi ở 100oC (không hấp tiệt trùng 121oC)
+ Làm nguội đến 5-50oC, xoáy hoặc khuấy nhẹ nhàng để đồng nhất Bước 2:
+ Thêm 250 mg chất bổ sung S2 CHROMagarTMmSuperCARBATM trong 2 ml nước cất
+ Khuấy cho đến khi hịa tan hồn tồn + Lọc qua giấy lọc tiệt trùng lỗ 0,45 µm Bước 3:
+ Thêm 2 ml chất bổ sung S2 vào dung dịch ở Bước 1 ở 45-50oC + Xoáy hoặc khuấy nhẹ nhàng để đồng nhất
Bước 4:
+ Đổ vào các đĩa Petri vô trùng + Để đông đặc và khô
+ Lưu trữ ở nơi tối
+ Mơi trường đã pha chế có thể giữ được 1 ngày ở nhiệt độ phịng
+ Các đĩa có thể lưu giữ đến 1 tháng trong tủ lạnh 2-8oC nếu được chuẩn bị đúng cách và được bảo vệ khỏi ánh sáng và sự mất nước.
2.4.3.2. Kiểm sốt chất lượng mơi trường ni cấy
Kiểm tra tính vơ trùng của mơi trường: Lấy 3-5% lượng đĩa thạch đã đổ cho vào tủ ấm 37oC, qua đêm:
+ Đạt: khi đĩa không mọc vi khuẩn, nấm
+ Không đạt: khi đĩa mọc vi khuẩn, nấm (loại bỏ lô môi trường) Sử dụng chủng chuẩn để kiểm tra chất lượng mơi trường:
Chủng chuẩn Hình thái khuẩn lạc
E. coli IMP NCTC 13476 Hồng đậm đến đỏ
K. pneumoniae ATCC® BAA 1705 Xanh kim loại
K. pneumoniae KPC NCTC 13438 Xanh kim loại
E. faecalis ATCC® 29212 Ức chế K. pneumoniae ATCC®700603 Ức chế A. baumannii K. pneumoniae P. aeruginosa E. coli
Vi sinh vật Hình thái khuẩn lạc
Acinetobacter baumannii Màu kem
Klebsiella pneumoniae Xanh kim loại
Pseudomonas aeruginosa Mờ, có/khơng màu kem đến xanh
Escherichia coli Hồng đậm đến đỏ
Gram (+) Ức chế
2.4.3.3. Kỹ thuật lấy mẫu bệnh phẩm
Kỹ thuật lấy bệnh phẩm ngoáy trực tràng:
+ Để bệnh nhân với tư thế nằm nghiêng về một bên, chân trên co, chân dưới duỗi + Một tay vén mông bộc lộ lỗ hậu môn
+ Đưa tăm bông vào khoảng 3 cm, xoay tăm bơng 1-3 vịng, tăm bông chuyển màu đạt yêu cầu.
Các bệnh phẩm sau khi thu thập sẽ được bảo quản ở nhiệt độ thường và chuyển ngay đến Khoa xét nghiệm
2.4.3.4. Kỹ thuật nuôi cấy, phân lập vi khuẩn A. baumannii kháng carbapenem sử dụng môi trường sàng lọc CHROMagarTMmSuperCARBATM
- Đặt môi trường chọn lọc CHROMagarTMmSuperCARBATM vào tủ ấm 37oC trước khi sử dụng 30 phút
- Ghi mã nghiên cứu, mẫu lấy lần thứ mấy, loại bệnh phẩm, ngày lấy mẫu. - Bệnh phẩm ngốy trực tràng/phân được ni cấy trên môi trường sàng lọc CHROMagarTMmSuperCARBATM.
- Các đĩa nuôi cấy được để tủ ấm 37°C.
- Định danh các loại khuẩn lạc mọc trên môi trường nuôi cấy bằng máy MALDI Biotyper.
- Cấy chuyển
+ Dùng thạch thường, ghi mã số nghiên cứu, loại bệnh phẩm, tên vi khuẩn, loại môi trường nuôi cấy, ngày lấy mẫu
Hình 2.2: Các bƣớc nuôi cấy, phân lập vi khuẩn từ bệnh phẩm ngoáy trực tràng/phân
1- Mẫu bệnh phẩm ngoáy trực tràng
2- Nuôi cấy bệnh phẩm trên môi trường CHROMagarTMmSuperCARBATM 3- Các loại vi khuẩn trên môi trường CHROMagarTMmSuperCARBATM
2.4.3.5 . Phương pháp định danh vi khuẩn bằng máy MALDI Biotyper
Định danh vi khuẩn bằng máy MALDI Biotyper
Chuẩn bị hoá chất:
Pha―Stock Solution‖: Dung môi dùng cho HCCA Matrix và Bruker Test Standard (BTS).
1. Lấy 1 ống Eppendorf và cho vào đó 475 μL nước siêu tinh khiết, 500 μL Acetonitrile (ACN) 100% và 25 μL Trifluoracetic acid 100% (TFA).
2. Trộn đều bằng vortex. Như vậy ta có được 1 mL hỗn hợp, gọi là ―stock solution‖. Stock solution có thể bảo quản ở nhiệt độ phịng.
Pha HCCA Matrix: hóa chất định danh
1. Lấy 1 ống HCCA Matrix, cho vào đó 250 μL stock solution.
2. Vortex ở nhiệt độ phòng cho đến khi thu được dung dịch trong suốt (tất cả tinh thể HCCA đều được hòa tan, nồng độ cuối là 10 mg HCCA/mL).
3. Dung dịch HCCA Matrix đã sẵn sàng để sử dụng
Dung dịch HCCA Matrix đã chuẩn bị được bảo quản ở nhiệt độ phòng và tránh ánh sáng trực tiếp. Sử dụng trong vòng 2 tuần kể từ ngày chuẩn bị.
Hình 2.3 : Hóa chất định danh MALDI-TOF
Pha Bruker Test Standard (BTS): hóa chất chuẩn
1. Lấy 1 ống BTS, cho vào đó 50 μL stock solution. Dùng pipet trộn ít nhất 20 lần ở nhiệt độ phịng, tránh tạo bọt.
2. Để ở nhiệt độ phịng 5 phút, sau đó lại trộn lại ít nhất 20 lần, tránh tạo bọt. 3. Nếu dung dịch vẫn còn đục, thực hiện quay ly tâm 2 phút với tốc độ 13000
rpm ở nhiệt độ phòng.
4. Dung dịch BTS đã sẵn sàng để sử dụng. Nên chia nhỏ ra làm nhiều ống (chẳng hạn chia làm 10 ống, mỗi ống 5 μL) và bảo quản ở nhiệt độ dưới - 18oC. Nếu thao tác chuẩn bị tốt, dung dịch BTS có thể bền trong 5 tháng ở điều kiện bảo quản đã nêu ở trên.
Hình 2.5 : Hệ thống máy định danh MALDI-TOF
Quy trình thực hiện định danh vi khuẩn bằng hệ thống MALDI-TOF:
Mẫu là khuẩn lạc tươi, đối với những lồi vi sinh vật chậm phát triển có thể sử dụng mẫu cấy sau vài ngày. Không nên bảo quản các đĩa chứa khuẩn lạc dưới 4oC bởi vì điều này dẫn đến sự suy giảm chất lượng phổ rất nhanh chóng. Tuy nhiên, có thể bảo quản các đĩa khuẩn lạc ở nhiệt độ phịng trong vài ngày.
Quy trình chuẩn bị mẫu cho chạy MALDI TOF như sau:
- Ghi sơ đồ mẫu;
- Nhỏ 1 μL dung dịch BTS vào một vị trí của đĩa MALDI TOF; - Phết mỗi mẫu khuẩn lạc thuần lên một vị trí của đĩa MALDI TOF;
- Lưu ý chỉ phết một lượng nhỏ khuẩn lạc (vừa đủ nhìn thấy), có thể sử dụng tăm tiệt trùng để phết;
- Để mẫu khơ ở nhiệt độ phịng;
- Cho 1 μL dung dịch HCCA Matrix lên mỗi vị trí mẫu; - Để khơ ở nhiệt độ phịng (5 – 20 phút);
- Đưa đĩa MALDI TOF vào máy MALDI Biotyper để thực hiện định danh; - Khởi động hệ thống:
Hình 2.6: Sơ đồ định danh bằng máy MALDI-TOF
1- Phết vi khuẩn lên vị trí đĩa
2- Nhỏ hóa chất định danh HCCA Matrix
3- Khởi động hệ thống và nhập thông tin mẫu bệnh phẩm 4- Đưa đĩa vào máy
5- Phân tích mẫu tự động cho ra các khối phổ 6- Kết quả định danh
Nhận định kết quả:
Giá trị Phiên giải
2.000 … 3.000 Độ tin cậy cao
1.700… 1.999 Độ tin cậy trung bình 0.000…1.699 Khơng tin cậy
+ Kết quả mức xanh lá cây ứng với giá trị ≥ 2: Độ tin cậy cao, có thể chính xác đến cấp độ loài.
1 2 3
4 5
+ Kết quả mức vàng ứng với giá trị ≥ 1.7 và ≤ 1.999: Độ tin cậy trung bình, có kết quả chính xác cấp độ chi.
+ Kết quả mức đỏ ứng với giá trị < 1.7: Khơng có kết quả định danh hoặc kết quả không tin cậy.
Trả kết quả khi đạt được kết quả màu xanh lá cây, làm thêm một số xét nghiệm định danh khi kết quả màu vàng.
** Lưu giữ các chủng sau khi phân lập định danh được.
2.4.3.6. Phương pháp lưu giữ chủng vi khuẩn
a, Chuẩn bị môi trường lưu giữ chủng vi khuẩn
Công thức pha môi trường lưu giữ chủng theo tỷ lệ như sau: Skim milk: 10 g, Nước RO: 100 ml, Glycerol: 30 ml
Cân chính xác 10 g bột Skim milk, cho vào 100 ml nước RO, hịa tan mơi trường bằng cách đun sơi cho tan hồn toàn.
Điều chỉnh pH khi nhiệt độ về 45-50oC, điều chỉnh pH mơi trường về 7,4 ± 0,2. Hóa chất sử dụng để điều chỉnh pH là natrihydroxit (NaOH) 10-12% và dung dịch acid chlohydic (HCl) 10-12%.
Hấp tiệt trùng ở 121oC trong 15 phút;
Để nguội môi trường về nhiệt độ khoảng 45-50oC, nhiệt độ này được kiểm tra bằng cách đặt mu bàn tay lên bình thạch;
Đo pH mơi trường bằng cách đổ khoảng 10 ml canh thang ra một ống thủy tinh vô trùng rồi đo pH bằng máy đo pH, nếu pH bằng 7 ± 0,2 thì khơng cần chỉnh lại pH cịn nếu khơng trong khoảng này cần chỉnh lại bằng dung dịch NaOH 10 – 12% hoặc dung dịch acid hydrochloric (HCl) 10-12%.
Lắc đều, cho 30 ml glycerol đã hấp tiệt trùng vào bình skim milk, lắc đều sau đó đổ mơi trường trong tủ Cleanbech, rót ra cốc mỏ 50 ml canh thang đã tiệt trùng rồi đong dần sang ống cryotube khoảng 0,5-1 ml thạch vào 1 ống;
Sau khi thạch đã được đóng gói, lấy 3-5% cho vào tủ ấm 37oC để qua đêm để kiểm tra tính vơ trùng của môi trường;
Kiểm tra môi trường để qua đêm trong tủ ấm 37oC, khơng có vi khuẩn mọc là đạt yêu cầu bằng cách:
+ Lấy ngẫu nhiên 3 ống: một ống bắt đầu đổ, một ống giữa mẻ đổ, một ống cuối mẻ đổ cấy vào thạch máu để kiểm tra chất lượng mỗi mẻ môi trường mới sản xuất.
Kết quả: Đạt khi vi khuẩn khơng mọc, khơng đạt khi có vi khuẩn mọc. - Ghi chép vào sổ pha môi trường và sổ kiểm tra chất lượng môi trường.
b, Lưu giữ chủng vi khuẩn
Chủng vi khuẩn sau khi được định danh sẽ được tăng sinh, giữ chủng và lưu ở tủ -70oC Môi trường lưu giữ chủng: skim milk + 30% glycerol
- Dán nhãn ống giữ chủng đầy đủ các thông tin: Mã bệnh phẩm, loại bệnh phẩm, tên chủng vi khuẩn, ngày lưu giữ chủng.
- Dùng tăm bông hoặc que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc thuần từ đĩa môi trường nuôi cấy và đưa vào ống giữ chủng (chủng vi khuẩn được hịa tan vào mơi trường để đảm bảo tính đồng nhất).
- Lưu chủng đã giữ vào tủ âm 70oC. - Lưu giữ lại danh sách các chủng.