STT Tên mồi Trình tự Tm (0C) Kích thƣớc sản phẩm (bp) 1 OsHKT1-1 Fw: CATACTCGTTGGCTCGTTGC 54 499 Rv: ATCACAGTGCTTGCCGAGTT 2 OsHKT1-2 Fw:TGAAGCCAAGCAACCCAGAA 55 828 Rv:CAGCACCGAACAATGTGACC 3 OsHKT1-3 Fw: TGGCCTTATGGCTTCCTTGG 54 603 Rv: ATTGGCTTGATGCCCAGTGT 4 OsHKT1-4 Fw: GGCATTTTCACAGCTTGCCT 55 668 Rv: GGCATTTTCACAGCTTGCCT
Chú thích: Fw: mồi xi , Rv: mồi ngƣợc
2.1.3.Hóa chất
2.1.3.1 Các hóa chất đƣợc sử dụng để tách DNA tổng số
Hoá chất tách chiết DNA bao gồm: Tris HCl, EDTA, NaCl, CTAB, Chloroform, isopropanol, isoamyl alcohol, Ethanol
- Đệm tách chiết DNA tổng số (đệm CTAB):
CTAB 1%
Tris-HCl 0,1M
EDTA 0,5M, pH 8,0
NaCl 5M
Tris 1M, pH = 8,0
NaCl 5M
EDTA 0,5M, pH 8,0
2.1.3.2 Môi trƣờng trồng thủy canh
Bảng 2.3 Thành phần các nguyên tố đa lƣợng trong môi trƣờng thủy canh[44,56] Nguyên tố Hóa chất Lƣợng cần pha trong 30ml dd thủy canh Lƣợng cần pha trong 1L dd thủy canh N NH4NO3 2,741g 1,25ml P NaH2PO4 1,217g 1,25ml K KNO3 2,486g 1,25ml Ca CaCl2.2H2O 3,5205g 1,25ml Mg MgSO4.7H2O 9,72g 1,25ml Muối NaCl 5,85g 11,7g
Bảng 2.4. Thành phần các nguyên tố vi lƣợng trong môi trƣờng thủy canh[44,56]
STT Nguyên
tố Hóa chất
Lƣợng hóa chất cần pha (g ) trong 30ml dung dịch thủy
canh 1 Mn MnCl2 .4H2O 0.0450 2 Mo (NH4)6Mo7O24 .4H2O 0.00222 3 B H3BO3 0.0280 4 Zn ZnSO4 .7H2O 0.00105 5 Cu CuSO4 .5H2O 0.00093 6 Fe FeCl3 .6H2O 0.2310 7 C6H8O7 .H2O 0.3570
19
2.1.3.3. Phản ứng PCR đƣợc thực hiện cùng với Taq DNA polymerase, Taq buffer, dNTPs, mồi đặc hiệu.
2.1.3.4. Sản phẩm phản ứng PCR đƣợc hiển thị bằng phƣơng pháp điện di, sử dụng các hóa chất : Agarose, Ethidium bromide; Tris base, EDTA, Maker 1kb và Dye 1X
Các hóa chất và dụng cụ dùng trong phịng thí nghiệm đƣợc cung cấp bởi các hãng có uy tín trên thế giới nhƣ: Sigma, Invitrogen, Bioneer, Fermentas, Merk, Promega, Corning, Prolabo, ICN và Labscan.
Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch sử dụng bộ kit tinh sạch Gene JET PCR Purification Kit #0701 của hãng Thermo scientific.
2.1.4. Thiết bị
Các thiết bị máy móc phục vụ cho nghiên cứu nhƣ : máy PCR nhân gen PCR 9700 Applied Biosystems-Mỹ, máy PCR Kyratec-Úc, máy ly tâm Mikro 22R Hettich-Đức, máy nghiền mẫu Retsch-Đức, máy soi gel Doc XR Biorad - Mỹ, bể ổn nhiệt, bể điện di…thuộc Phịng thí nghiệm Bộ mơn Di truyền học, Phịng sinh học thụ thể và phát triển thuốc - thuộc Phịng thí nghiệm Trọng Điểm Công nghệ Enzyme- Protein, Phịng phân tích di truyền-Trung tâm nghiên cứu Khoa học sự sống, Trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên- Đại học Quốc Gia Hà Nội.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1.Trồng lúa sử dụng phƣơng pháp thủy canh và thí nghiệm xử lý mặn 2.2.1.1 Trồng lúa sử dụng phƣơng pháp thủy canh
Tiến hành chọn lọc hạt lúa, ủ hạt. Khi hạt lúa nảy mầm đƣợc đặt vào trong những ơ trên tấm xốp có đan lƣới, đặt lọt khít vào trong khay nhựa chứa 1l môi trƣờng dinh dƣỡng. Mỗi tấm xốp gồm 13 ô, mỗi giống đƣợc gieo trên một ô, mỗi ô đƣợc gieo 3 hạt. Các giống lúa đƣợc trồng trong 6 khay đƣợc trình bày ở bảng 2.5. Sau khi lúa đƣợc trồng 14 ngày tiến hành bổ sung NaCl để đạt nồng độ 100mM ở các khay thuộc nhóm B bảng 2.5. Mơi trƣờng dinh dƣỡng đƣợc thay 4 ngày/lần và điều chỉnh pH ở độ pH =5.
Bảng 2.5. Bố trí thí nghiệm đánh giá khả năng chịu mặn của các giống lúa NHÓM A: Đối chứng NHÓM A: Đối chứng
Khay 1
Nếp nõn tre Nƣớc mặn dạng
2 Nipponbare IR28 Nếp vải Ré nƣớc Chiêm cũ Hom râu
Nếp ốc Ngoi Dâu Ấn Độ Pokkali IR 29
Khay 2
Dâu Ấn Độ IR28 Hom râu Nƣớc mặn dạng 2
Ngoi Chiêm cũ Ré nƣớc IR29
Nếp nõn tre Nếp vải Nipponbare Pokkali Nếp ốc
Khay 3 Nếp ốc Pokkali Nipponbare Nếp vải Nếp nõn tre Chiêm cũ IR29 Ngoi Ré nƣớc
Nƣớc mặn
dạng 2 Hom râu IR28 Dâu Ấn Độ
NHÓM B: Xử lý mặn Khay 1
Nếp nõn tre Nƣớc mặn dạng
2 Nipponbare IR28 Nếp vải Ré nƣớc Chiêm cũ Hom râu
Nếp ốc Ngoi Dâu Ấn Độ Pokkali IR 29
Khay 2
Dâu Ấn Độ IR28 Hom râu Nƣớc mặn dạng 2 Ngoi Chiêm cũ Ré nƣớc IR29 Nếp nõn tre Nếp vải Nipponbare Pokkali Nếp ốc
Khay 3 Nếp ốc Pokkali Nipponbare Nếp vải Nếp nõn tre Chiêm cũ IR29 Ngoi Ré nƣớc
Nƣớc mặn
dạng 2 Hom râu IR28 Dâu Ấn Độ
2.2.1.2. Thí nghiệm xử lý mặn
Khi cây lúa trồng đƣợc 14 ngày trong môi trƣờng thủy canh tiến hành bổ sung 11,7g muối/1l mơi trƣờng thủy canh vào nhóm B nhƣ ở bảng 2.5, sau
21
giá SES(Standar Evaluating Score) của IRRI, 1997.( bảng 2.6). Đồng thời đánh giá một số chỉ tiêu sinh lý nhƣ: chiều dài thân(cm), chiều dài rễ(cm), khối lƣợng thân(g), khối lƣợng rễ(g).
Bảng 2.6. Tiêu chuẩn đánh giá (SES) ở giai đoạn tăng trƣởng và phát triển
Điểm Quan sát
1 Lá gần nhƣ bình thƣờng, khơ nhẹ ở đầu lá
3 1/4 lá bị khô hoặc bị mất màu
5 1/4 - ít hơn 1/2 lá bị khô hoặc bị mất màu
7 1/2 - ít hơn 3/4 lá bị khô hoặc mất màu
9 Hầu nhƣ tất cả các cây đã chết
2.2.2. Tách chiết DNA tổng số
Để thu DNA tổng số phục vụ cho nhân bản và giải trình tự gen, chúng tơi tiến hành tách chiết DNA tổng số theo phƣơng pháp CTAB: là phƣơng pháp sử dụng chất có hoạt tính bề mặt là cation CTAB. Đây là phƣơng pháp đơn giản nhất thƣờng đƣợc sử dụng để tách chiết DNA từ thực vật dựa trên nguyên lý chung sau:
- Bƣớc 1: Phá màng tế bào và màng nhân.
Nghiền các mô, tế bào bằng biện pháp cơ học: nghiền trong đá khô, nitơ lỏng bằng cối, chày sứ để phá vỡ thành cellulose, giải phóng các thành phần trong tế bào. Sử dụng đệm có chất tẩy (CTAB) để phá vỡ màng bào, giải phóng DNA. Sử dụng các loại hóa chất (phổ biến là EDTA) để bảo vệ DNA khỏi sự phân hủy của các enzyme nuclease nội bào .
- Bƣớc 2: Loại tạp.
Các hóa chất nhƣ: chloroform, isoamyl alcohol, phenol… đƣợc sử dụng để biến tính protein. Protein bị biến tính sau khi ly tâm tủa thành 1 lớp nằm giữa pha nƣớc và pha hóa chất. Pha nƣớc chứa acid nucleic đƣợc thu nhận lại.
- Bƣớc 3: Tủa acid nucleic.
Mục đích của việc tủa là nhằm thu nhận acid nucleic dƣới dạng cô đặc để bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme và có thể hịa tan chúng lại theo nồng độ mong muốn. Có thể tủa bằng ethanol hoặc isopropanol nhƣng isopropanol phổ biến hơn. Acid nucleic sẽ đƣợc thu nhận lại bằng ly tâm. Sau đó, cặn tủa đƣợc rửa trong ethanol 70% để loại muối hoặc isopropanol cịn dính lại trên mẫu .
Các bƣớc tiến hành:
1. Cho 50mg mẫu lá lúa đã nghiền vào ống eppendorf 2ml có chứa 500µl dung dịch đệm CTAB buffer 2X, vortex
2. Ủ ở 650C khoảng 15 phút
3. Lấy ra để nhiệt độ hạ xuống, bổ sung 500µl chloroform/ isoamylalcohol (24:1), vortex 15 giây
4. Ly tâm (10000rpm/10 min), 40C
5. Thu dịch pha trên (300µl) chuyển sang ống eppendorf 1,5ml mới có chứa 300µl isopropanol để tủa DNA để 10 phút trong đá lạnh.
6. Ly tâm (14000rpm/5min) , 40C
7. Rửa tủa bằng 500µl EtOH 700 , ly tâm 14000rpm/5min, để khơ 8. Bổ sung 50µl TE buffer và bảo quản ở -200C
Sau khi tách chiết DNA tổng số, DNA tổng số đƣợc kiểm tra chất lƣợng bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 1% trong dung dịch đệm TAE (Tris base, acid acetic, EDTA) ở 90V trong 30 phút. DNA tổng số đƣợc so sánh với maker 1kb và có thể quan sát đƣợc dƣới tia UV khi nhuộm Ethidium Bromide
2.2.3.Phƣơng pháp PCR
PCR đƣợc thực hiện với các cặp mồi đặc hiệu để nhân bản đoạn gen OsHKT1 mã hóa cho protein vận chuyển ion ở một số giống lúa.
23
Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose, dung dich đệm TAE, ở 90V trong 30 phút. Kích thƣớc tƣơng đối của sản phẩm đƣợc so sánh với maker 100bp và quan sát dƣới tia UV khi nhuộm ethidium bromide.
Bảng 2.7 Thành phần phản ứng PCR Thành phần phản Thành phần phản ứng Nồng độ cuối cùng Thể tích (50µl) ADN tổng số 570ng/nl 1,5 dNTPs 2mM 5 Buffer (+Mg2+ ) 10X 5 Mồi Fw 10µM 1,5 Mồi Rv 10µM 1,5 Taq 5U 0.3 H2O 35.2 Bảng 2.8.Chu trình nhiệt phản ứng PCR
Nhiệt độ (0C) Thời gian Số chu kỳ
95 5’ 94 30s 35Cycles 55 30s 72 1’ 72 7’ 4 ∞
I.
2.2.4.Tinh sạch
Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch sử dụng Kit tinh sạch của hãng Thermo. Quy trình tinh sạch đƣợc thực hiện theo đúng hƣớng dẫn của nhà sản xuất.
2.2.5.Phần mềm sử dụng để phân tích số liệu
Kết quả giải trình tự đƣợc so sánh và đối chiếu với ngân hàng dữ liệu gene lúa cũng nhƣ đƣợc so sánh giữa các giống lúa với nhau ở các cặp mồi tƣơng ứng sử dụng công cụ tin sinh học:
http://www.cellbiol.com/scripts/complement/dna_sequence_reverse_compleme
nt.php
http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Đánh giá khả năng chịu mặn của các giống lúa
Khi cây lúa trồng đƣợc 14 ngày trong môi trƣờng dung dịch Yoshida tiến hành bổ sung 11,7g muối/1l dung dịch thủy canh vào nhóm B nhƣ ở hình 7, sau khi bổ sung NaCl đƣợc 3, 7, 14 ngày tiến hành đánh giá mức độ chịu mặn của cây lúa dựa vào đặc điểm hình thái sinh lý của cây theo tiêu chuẩn đánh giá SES(Standar Evaluating Score) của IRRI, 1997.(Hình 8,9,10).
Hình 7. Lúa trồng trƣớc khi xử lý mặn mặn
Hình 8. Lúa sau 3 ngày xử lý mặn
Kết quả ban đầu cho thấy, lúa đƣợc trồng trong mơi trƣờng dinh dƣỡng có muối với nồng độ đạt 100mM sau 3 ngày xử lý mặn có các giống chƣa bị ảnh hƣởng nhiều. Giống tốt nhất là giống Pokkali , giống kém nhất là IR29 (Hình 11.).
Hình 11.Đồ thị đánh giá ảnh hƣởng của điều kiện mặn lên đặc điểm hình thái của cây lúa sau 3 ngày
Đồ thị biểu thị giá trị trung bình (± SE) của 9 lần lặp lại Trục tung biểu thị thang điểm theo tiêu chuẩn SES
Trục hoành biểu thị tên giống được sắp xếp từ kháng tốt nhất đến kháng kém nhất từ trái qua phải
Sau 7 ngày xử lý mặn có 30,76% giống bị ảnh hƣởng cấp độ 1-3 gồm các giống: Pokkali, Nếp nõn tre, Nếp ốc, Hom râu. Giống bị ảnh hƣởng cấp độ 4- 6 có 30,76% bao gồm : Ré nƣớc, Mặn D2, Ngoi, Chiêm cũ. Có 15,4% giống bị ảnh hƣởng cấp độ 8-9 gồm các giống: chuẩn nhiễm IR28, IR29(Hình 12).
Đồ thị biểu thị giá trị trung bình (± SE) của 9 lần lặp lại Trục tung biểu thị thang điểm theo tiêu chuẩn SES
Trục hoành biểu thị tên giống được sắp xếp từ kháng tốt nhất đến kháng kém nhất từ trái qua phải
Sau 14 ngày xử lý mặn kết quả thu đƣợc : 46,15% các giống: Chiêm cũ, Nếp vải, Dâu Ấn độ, Nipponbare, IR28, IR29 ảnh hƣởng cấp độ 9. Các giống ảnh hƣởng cấp độ 4-6 gồm: Nếp nõn tre, Nếp ốc, Hom râu, Ré nƣớc, Mặn D2, Ngoi. Giống bị chịu ảnh hƣởng ít nhất là Pokkali chiếm 0,76%(Hình 13).
Hình13 .Đánh giá ảnh hƣởng của điều kiện mặn lên đặc điểm hình thái của cây lúa sau 14 ngày
Đồ thị biểu thị giá trị trung bình (± SE) của 9 lần lặp lại Trục tung biểu thị thang điểm theo tiêu chuẩn SES
Trục hoành biểu thị tên giống được sắp xếp từ kháng tốt nhất đến kháng kém nhất từ trái qua phải
Kết quả cho thấy sau 14 ngày sự khác biệt tính kháng mặn của các giống là tốt nhất. Do đó sự phân biệt tính kháng giữa các giống đƣợc chọn sau 14 ngày.
Sau khi đánh giá ảnh hƣởng của điều kiện mặn lên đặc điểm hình thái sinh lý của cây lúa, chúng tôi tiến hành đánh giá ảnh hƣởng của điều kiện mặn lên một số đặc điểm sinh lý của cây lúa: Chiều dài thân, chiều dài rễ, khối lƣợng thân, khối lƣợng rễ.
3.2Đánh giá ảnh hƣởng của điều kiện mặn lên một số đặc điểm sinh lý của cây lúa
3.2.1 Kết quả đánh giá về chiều dài thân sau khi xử lý mặn
Kết quả sau khi xử lý mặn 3 ngày cho thấy lúa đƣợc trồng trong mơi trƣờng dinh dƣỡng có muối với nồng độ đạt 100mM, kết quả ghi nhận cho thấy có 71,42% giống lúa có chiều cao trong khoảng từ 6-8cm bao gồm 10 giống lúa sau: IR29, Nếp vải, Nipponbare, IR28,Mặn D2, Dấu Ấn độ, Chiêm cũ, Ré nƣớc, Ngoi. Có 4 giống (28,58%) có chiều cao từ 8,5- 9,5cm là các giống: Pokkali, Nếp nõn tre, Hom râu, Nếp ốc (Hình 14.).
Hình 14. Đồ thị biểu diễn chiều dài thân lúa sau 3 ngày xử lý mặn
Đồ thị biểu thị giá trị trung bình (± SE) của 9 lần lặp lại Trục tung biểu thị chiều dài thân lúa (cm)
Trục hoành biểu thị tên giống được sắp xếp từ giống kháng kém nhất đến kháng tốt nhất từ trái qua phải
Kết quả sau 7 ngày xử lý mặn cho thấy các giống có chiều cao thân so với 3 ngày xử lý mặn khơng có nhiều vƣợt trội, cụ thể nhƣ sau: Các giống đối chứng có 57,14% các giống có chiều cao từ 7-8cm, có 21,4% giống có chiều cao trên 8cm gồm các giống: Ngoi, Nếp ốc. Giống có chiều cao vƣợt trội nhất là giống chuẩn kháng Pokkali (9,7cm) đạt 7,14%. Các giống có chiều cao ngang với giống chuẩn kháng đạt 14,28% gồm hai giống: Hom râu, Nếp nõn tre. Các giống lúa khi đã xử lý mặn những giống chống chịu kém có chiều cao khơng thay đổi so với 3 ngày khi xử lý mặn. Có 78,57% các giống có chiều
Qua kết quả đánh giá sau 7 ngày xử lý mặn giữa các giống đối chứng và bên lúa đƣợc cho thêm muối, ta thấy có 28,6% chiều dài thân của các giống có sự chênh lệch cao 2-2,5cm gồm các giống: IR29, Nếp vải, IR28, Nipponbare. Có 42,85% giống có chiều dài thân lớn hơn từ 1-1,5cm gồm các giống: Ré nƣớc, Ngoi, Mặn D2. Có 3 giống (21,4%) các giống có sự chênh lệch chiều dài thân 0,5cm đó là: Pokkaki, Nếp nõn tre, Hom râu, Nếp ốc (hình 15.).
Hình 15. Đồ thị biểu diễn chiều dài thân lúa sau 7 ngày xử lý mặn
Đồ thị biểu thị giá trị trung bình (± SE) của 9 lần lặp lại Trục tung biểu thị chiều dài thân lúa (cm)
Trục hoành biểu thị tên giống được sắp xếp từ giống kháng kém nhất đến kháng tốt nhất từ trái qua phải
Sa 14 ngày xử lý mặn, chiều dài thân của các giống đã có sự chênh lệch rõ rệt giữa các giống đối chứng và các khay giống xử lý mặn. Chiều dài thân bên nhóm đối chứng cao hơn nhóm xử lý mặn khoảng 3-4cm giữa các giống chiếm 58,15% gồm các giống: IR29, IR28, Nếp vải, Nipponbare, Dấu Ấn độ, Mặn D2, Chiêm cũ. Các giống có sự khác nhau về chiều dài thân từ 0,5-1cm chiếm 42,85% là: Ngoi, Nếp ốc, Pokkali, Nếp nõn tre, Hom râu (Hình 16.).
Hình 16. Đồ thị biểu diễn chiều dài thân lúa sau 14 ngày xử lý mặn
Đồ thị biểu thị giá trị trung bình (± SE) của 9 lần lặp lại Trục tung biểu thị chiều dài thân lúa (cm)
Trục hoành biểu thị tên giống được sắp xếp từ giống kháng kém nhất đến kháng tốt nhất từ trái qua phải
3.2.2 Kết quả đánh giá chiều dài rễ sau khi xử lý mặn
Sau 3 ngày xử lý mặn, các giống lúa có chiều dài rễ từ 7-8,5cm chiếm 71,42%. Cịn lại 28,58% là 3 giống có chiều dài rễ lớn hơn 8,5cm bao gồm các giống: Hom râu, Pokkali, Nếp nõn tre (Hình 17.). Sự chênh lệch chiều dài rễ sau 3 ngày xử lý mặn chƣa có sự thay đổi lớn.
Hình 17. Đồ thị biểu diễn chiều dài rễ lúa sau 3 ngày xử lý mặn
Đồ thị biểu thị giá trị trung bình (± SE) của 9 lần lặp lại Trục tung biểu thị chiều dài thân lúa (cm)
Trục hoành biểu thị tên giống được sắp xếp từ giống kháng kém nhất đến kháng tốt nhất từ trái qua phải
rằng chiều dài rễ bên đối chứng phát triển bình thƣờng các giống có chiều dài tƣơng đồng nhau với chiều cao trong khoảng từ 9,5cm-10,5cm. Khi so sánh chiều dài rễ giữa các giống với nhau, thấy rằng gần 43% các giống có khoảng