Chƣơng 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.3. Ghép tế bào gốc trong điều trị bệnh thalassemia
1.3.1. Bệnh thalassemia
Thalassemia là bệnh đơn gen phổ biến do rối loạn tổng hợp hemoglobin (Hb). Bệnh có 2 nhóm lớn là α và β-thalassemia. Trong nhóm α-thalassemia 1 và α- thalassemia 2 xảy ra ở người có 2 hoặc 1 gen α-globin đột biến với thiếu máu nhược sắc nhẹ và thường không biểu hiện lâm sàng [66]. Đối với nhóm β-thalassemia, thể dị hợp tử mang 1 gen β-globin bị đột biến biểu hiện thiếu máu nhược sắc nhẹ [55]. Tỷ lệ người mang gen bệnh ở Việt Nam khá cao, thay đổi theo địa dư và nhóm dân tộc. Một số nơi tỷ lệ mang gen β-thalassemia gần 25% và α-thalassemia 9% [4, 5]. Tổ chức Y tế Thế giới chọn thalassemia là một trong những ưu tiên hàng đầu về nghiên cứu di truyền ở người Đông Nam Á.
Lê Xuân Thịnh K24 - Sinh học
Alpha thalasemia gây ra bởi đột biến gen α-globin nằm trên cánh ngắn của NST 16 dẫn đến thiếu hụt hoặc không tổng hợp chuỗi alpha globin. Người bình thường bản sao gen α-globin nằm trên 2 NST số 16, trên mỗi một NST chứa 2 bản sao gen α globin: HbA1 (chiều dài 840 bp, gồm 3 exon và 2 intron) gọi là gen α1 và HbA2 (chiều dài 830bp, gồm 3 exon và 2 intron) gọi là gen α2. Gen α1 và α2 đều
mã hóa chuỗi α globin gồm 141 acid amin nhưng do quá trình khởi động (promoter) của 2 gen khác nhau nên khả năng biểu hiện của gen α2 mạnh hơn gen α1 từ 2 đến 3 lần. Vì vậy, các đột biến gen xảy ra ở gen α2 thường có hậu quả nặng nề hơn những đột biến ở gen α1 [27].
Beta thalasemia gây ra bởi đột biến β-globin bao gồm: β0 thalassemia là các đột biến làm mất chức năng gen β nên không tổng hợp được chuỗi β-globin, β+ thalassemia là các đột biến làm giảm chức năng gen β nên giảm tổng hợp chuỗi β- globin ở nhiều mức độ khác nhau. Đột biến điểm làm thay đổi một acid amin tổng hợp nên các biến thể chuỗi β-globin, biến thể khác tạo các Hb bất thường như βE. Hiện nay đã phát hiện được hơn 200 đột biến β globin, chủ yếu là đột biến không mất đoạn, rất hiếm gặp đột biến mất đoạn gen. Các đột biến mang tính đặc trưng và phân bố khác nhau giữa các vùng miền, dân tộc [24, 79].
1.3.2. Ghép tế bào gốc
Ghép tế bào gốc tạo máu là một phương pháp có giá trị cao trong điều trị không chỉ cho bệnh thalassemia mà còn với nhiều bệnh máu khác, đối với nhiều bệnh ghép tế bào gốc đồng lồi có thể chữa khỏi được bệnh hay kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân, nâng cao chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân. Khác với ghép thận, ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài với nguồn tế bào gốc lấy từ tủy xương hoặc tế bào máu ngoại vi, yêu cầu về mức độ hòa hợp HLA tối thiểu là 8/10 locus A, B,
C, DR, DQ [44]. Nguồn TBG máu dây rốn rất non trẻ, chưa bị tác động về mặt miễn
dịch như người trưởng thành, nên trong ghép tế bào gốc từ máu dây rốn cho phép hòa hợp HLA khơng hồn tồn ở mức 4/6 locus A, B, DR [49, 54]. Chính vì thế nên
Lê Xn Thịnh K24 - Sinh học
khả năng tìm kiếm được mẫu máu dây rốn hòa hợp tối thiểu 4/6 cho bệnh nhân ghép lên rất cao tới 97,7% [6].
1.4. Nghiên cứu hòa hợp HLA bệnh thalassemia ở Việt Nam và trên Thế giới
Năm 2004 ở trường đại học Chulalongkorn, Bangkok, Thailand tác giả Vanichsetakul P, Wacharaprechanont T đã nghiên cứu và khẳng định máu dây rốn là một lựa chọn hợp lý, khả quan để ghép cho bệnh thalassemia [74].
Nghiên cứu của tác giả Lê Xuân Hải và cộng sự (2013) với 761 trường hợp bệnh nhân ghép và người hiến tạng làm xét nghiệm HLA tại Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương chỉ có 32,2% bệnh nhân cần ghép tủy có thể tìm được người cho tế bào gốc tạo máu hòa hợp HLA từ anh, chị, em ruột [3].
Tương tự như thế, nghiên cứu của tác giả Trần Ngọc Quế và cộng sự (2015) với 175 bệnh nhân cần điều trị bằng ghép tế bào gốc đồng lồi, chỉ có 41,5% số trường hợp tìm được người cho hịa hợp HLA cùng huyết thống. Trong khi đó, với xét nghiệm HLA độ phân giải cao cho 1008 mẫu máu dây rốn cộng đồng tại Ngân hàng Tế bào gốc Viện HH - TM TW, có tới 97,7% số trường hợp bệnh nhân đã tìm thấy mẫu máu dây rốn hịa hợp tối thiểu 4/6 alen của 3 locus chính A, B, DR [10].
Theo tác giả Smythe J. và cộng sự (2007) có khoảng 25% bệnh nhân cần cấy ghép tế bào gốc đồng lồi mà người anh/chị/em có HLA hòa hợp. Đối với một số trẻ em, đặc biệt là những người dân tộc thiểu số và những người bị rối loạn di truyền như bệnh lý hemoglobin hoặc suy giảm miễn dịch, thì khả năng tìm được nguồn tế bào gốc từ máu dây rốn của anh chị/em ruột cao hơn rất nhiều [63].
Khoảng 15 năm trở lại đây, máu dây rốn đã và đang trở thành nguồn quan trọng cung cấp tế bào gốc cho ghép đồng loài. Đây là một nguồn cung cấp tế bào gốc rất lớn, dễ thu thập mà bình thường sẽ bỏ đi, máu rất giàu tế bào định hướng sinh máu ở giai đoạn sớm và giai đoạn đa dòng, số lượng tế bào CD34+ từ 1/100 đến 1/10000 tế bào có nhân, khả năng sinh sản gấp 2 lần tế bào gốc tủy và máu ngoại vi người trưởng thành [65].
Lê Xuân Thịnh K24 - Sinh học
Chƣơng 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị 2.1. Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
80 bệnh nhân thalassemia có chỉ định điều trị bằng tế bào gốc, trong đó bao gồm: 58 bệnh nhân có người hiến cùng huyết thống là anh/chị/em ruột của bệnh nhân (55 mẫu tế bào ối và 3 người hiến tế bào gốc) và 22 bệnh nhân khơng có người hiến cùng huyết thống.
3000 đơn vị máu dây rốn từ Ngân hàng máu dây rốn cộng đồng Viện Huyết học - Truyền máu TW.
Tiêu chuẩn lựa chọn:
Bệnh nhân: Bệnh nhân thalassemia mức độ nặng có chỉ định điều trị bằng tế bào gốc và đồng ý tham gia nghiên cứu.
Người hiến: Mẫu tế bào ối được sàng lọc chẩn đốn trước sinh bình thường hoặc mang gen; người hiến tế bào gốc máu ngoại vi không bị bệnh thalassemia, trình trạng sức khỏe đủ điểu kiện hiến tế bào gốc; các đơn vị máu dây rốn đã được thu thập, xử lý, làm các xét nghiệm đánh giá và lưu trữ tại Ngân hàng Tế bào gốc, Viện Huyết học - Truyền máu TW; người hiến đồng ý tham gia nghiên cứu.
Tiêu chuẩn loại trừ:
Khơng đạt tiêu chí của tiêu chuẩn lựa chọn.
2.1.2. Hóa chất
Kit tách ADN OMEGA gồm: Cột lọc; các dung dịch đệm; OB Protease hoặc Ficoll; Kit PCR HLA-SSO cho 3 locus HLA-A, HLA-B, HLA-DRB1 gồm: dung dịch đệm cho PCR, hóa chất PCR, hóa chất cho phản ứng lai; dung dịch nhuộm huỳnh quang SA-PE; Taq polymerase và một số dung dịch phụ trợ khác.
Lê Xuân Thịnh K24 - Sinh học
2.1.3. Thiết bị
Hệ thống máy Luminex và phần mềm phân tích kết quả; máy PCR, máy lắc trộn, máy ly tâm nhanh, máy ủ nhiệt; bộ micro pipet các loại, pipet đa kênh, đầu cơn có màng lọc các loại, ống eppendorf 1,5 ml, strip 8 ống PCR 0,2ml; phiến nhựa 96 giếng 0,2 ml, giấy dán phiến; phần mềm quản lý Ngân hàng Tế bào gốc và các phương tiện hỗ trợ khác.
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
‐ Địa điểm nghiên cứu: Ngân hàng Tế bào gốc, Viện Huyết học - Truyền máu TW. ‐ Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 12/2015 đến tháng 6/2017.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Thiết kế nghiên cứu
‐ Nghiên cứu mô tả cắt ngang, hồi cứu và tiến cứu; ‐ Chọn mẫu thuận tiện.
2.3.2. Các bước tiến hành nghiên cứu
2.3.2.1. Xác định HLA của bệnh nhân và người hiến cùng huyết thống
Các trường hợp có chỉ định chọc hút dịch ối được chọc dịch ối tại Trung tâm Mô phôi của Học viện Quân y 103, sau khi đã hội chẩn sản khoa đủ điều kiện chọc ối. Q trình ni cấy tế bào dịch ối được thực hiện tại khoa Di truyền sinh học phân tử, Viện Huyết học - Truyền máu TW.
Tách ADN
ADN được tách chiết từ mẫu máu bệnh nhân thalassemia, dịch tế bào ối và máu dây rốn bằng kít tách ADN Omega. Quy trình gồm các bước chính như sau: Hút 250 µl máu bệnh phẩm cho vào ống eppendorf 1,5 ml; thêm 25 µl OB Protease và 250 µl đệm BL vào ống eppendorf, trộn đều và ủ 10 phút ở 65o
C; thêm 260µl cồn 100%, trộn đều trong 20 giây và ly tâm nhanh; chuyển hỗn hợp lên cột. ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch; chuyển cột sang ống mới, bổ sung 500 µl đệm HBC, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch, thấm miệng ống; thêm 700 µl
Lê Xuân Thịnh K24 - Sinh học
Wash Buffer, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 3 phút, bỏ dịch, thấm miệng ống. lặp lại bước này 2 lần; ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút để loại bỏ sạch Wash Buffer; chuyển cột sang ống eppendorf 1.5 ml mới. thêm 200 µl đệm EB, ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng và ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ cột, thu dịch chứa ADN và bảo quản ở -20oC.
Xác định HLA [33]
Xét nghiệm HLA bằng kỹ thuật PCR-SSO (Polymerase chain reaction- Sequence Specific Oligonucleotide) độ phân giải cao trên hệ thống Luminex.
Nguyên lý, kỹ thuật này gồm các bước: tách và ủ DNA của mẫu với đoạn mồi đặc hiệu tương ứng các gen HLA; khuếch đại các gen này bằng PCR; lai sản phẩm PCR với các đoạn đầu dò DNA đặc hiệu của các locus HLA ở độ phân giải cao đã biết và đồng thời mỗi loại hạt cịn được mã hóa riêng bằng màu laser; chạy mẫu và phân tích mẫu trên hệ thống Luminex để xác định HLA của mẫu.
Bước 1: Bước khuếch đại
Ủ ADN của mẫu với đoạn mồi đặc hiệu;
Chạy máy PCR theo chu trình: Biến tính lần đầu: 95oC trong 3 phút; lặp lại 12 chu kỳ (biến tính: 95oC trong 15 giây, gắn mồi: 60oC trong 30 giây, tổng hợp: 72oC trong 30 giây, tổng hợp bước cuối: 72oC trong 5 phút); lặp lại 28 chu kỳ (biến tính: 95oC trong 10 giây, gắn mồi: 63oC trong 30 giây, tổng hợp: 72oC trong 30 giây); tổng hợp bước cuối cùng: 72oC trong 2 phút; duy trì ở 4oC; Thu sản phẩm sau PCR.
Bước 2: Lai
Ủ sản phẩm PCR với hạt bead gắn với đầu dò;
Lai trên máy ủ nhiệt theo chu trình: Biến tính: 95oC trong 2 phút; gắn mồi: 47oC trong 10 phút; tổng hợp: 56oC trong 8 phút; Giữ ở 56oC;
Lê Xuân Thịnh K24 - Sinh học
Pha sẵn dung dịch huỳnh quang PE;
Ủ sản phẩm lai với dung dịch huỳnh quang; Thu sản phẩm sau ủ.
Bước 4: Phân tích kết quả trên máy:
Chạy mẫu trên hệ thống Luminex theo chương trình tự động; Phân tích kết quả sau chạy mẫu.
Hình 1.11. Phần mềm phân tích kết quả xác định alen của HLA
Kết quả minh họa locus A Hình 1.11 cho thấy rằng từ biểu đồ các tín hiệu của các đầu dị locus A (1), phần mềm sẽ lựu chọn các đầu dò locus A có tín hiệu dương tính (2), tiếp theo là đưa ra những gợi ý kết quả của locus A (3) và cuối cùng là tổng hợp kết quả của HLA-A (4).
Sự hòa hợp HLA giữa người hiến và người nhận: được mơ tả mức độ hịa hợp sử dụng 3 locus/(6 alen); người hiến mà có 1 bất đồng HLA được coi như là hịa hợp 5/6; người hiến mà có 2 bất đồng HLA được coi như là hòa hợp 4/6; nếu hịa hợp hồn tồn là 6/6. Trong đó yêu cầu tối thiểu HLA-A và HLA-B ở độ
Lê Xuân Thịnh K24 - Sinh học
phân giải thấp (mức độ kháng nguyên) và HLA-DRB1 ở độ phân giải cao tương đương với mức độ alen.
2.3.2.2. Xác định các chỉ số của đơn vị máu dây rốn cộng đồng
Xác định HLA của các đơn vị máu dây rốn cộng đồng được thực hiện theo quy trình như xác định HLA cho bệnh nhân và người hiến cùng huyết thống. Ngoài ra các đơn vị máu dây rốn cộng đồng còn được thực hiện các xét nghiệm đếm số lượng CD34+, đếm tế bào có nhân (TBCN), xác định nhóm máu để phục vụ cho việc tìm kiếm đơn vị tế bào gốc hịa hợp cho bệnh nhân.
2.3.2.3. Tìm kiếm người hiến hịa hợp cho bệnh nhân
- Tìm kiếm người hiến cùng huyết thống hòa hợp HLA với bệnh nhân;
- Tìm kiếm người hiến khơng cùng huyết thống hòa hợp HLA cho những bệnh nhân khơng có người hiến hoặc có người hiến cùng huyết thống nhưng khơng hịa hợp HLA.
Xác định HLA bằng kỹ thuật PCR-SSO
Hòa hợp HLA 21 bệnh nhân
Khơng hịa hợp HLA 37 bệnh nhân Xác định HLA bằng kỹ thuật PCR-SSO Xác định HLA bằng kỹ thuật PCR-SSO Đánh giá Hòa hợp HLA Thu thập, lƣu trữ TBG 59 BN tìm kiếm TBG MDRCĐ Lựa chọn đơn vị TBG phù hợp Chuẩn bị ghép 58 Ngƣời hiến cùng huyết thống 58 BN có ngƣời hiến cùng huyết thống 22 BN khơng có ngƣời hiến cùng huyết thống 80 Bệnh nhân thalassamia có chỉ định ghép
Lê Xuân Thịnh K24 - Sinh học
2.3.3. Chỉ số nghiên cứu
- Thông tin của bệnh nhân: tuổi, giới, dân tộc, cân nặng, thể bệnh;
- Thông tin của người hiến: người hiến cùng huyết thống, người hiến không cùng huyết thống;
- Chỉ số xét nghiệm HLA của bệnh nhân và người hiến cùng huyết thống; - Chỉ số xét nghiệm HLA của các đơn vị máu dây rốn cộng đồng;
- Thể tích khối TBG, số lượng tế bào CD34+, số lượng TBCN, nhóm máu ABO và Rh(D) của các đơn vị máu dây rốn cộng đồng.
Liều TBCN tối thiểu: 2x107 TB/kg; liều tế bào CD34+ tối thiểu 1x105 TB/kg cân nặng bệnh nhân.
Liều TBCN tối ưu với hòa hợp 4/6: 5x107 TB/kg; với hòa hợp 5/6: 4x107 TB/kg; với hòa hợp 6/6: 3x107 TB/kg cân nặng bệnh nhân.
- Chỉ số hòa hợp HLA giữa bệnh nhân và người hiến, yêu cầu về mức độ hòa hợp HLA tối thiểu 4/6 locus A, B, DR theo Hội ghép Tế bào gốc Quốc tế [44, 57, 72, 80].
2.3.4. Xử lý số liệu
Thu thập thông tin theo biểu mẫu phiếu thu thập thông tin.
Các số liệu thu thập được nhập và xử lý trên phần mềm SPSS 16.0.
2.3.5. Đạo đức nghiên cứu
Tiến hành nghiên cứu trung thực.
Thơng tin rõ mục đích của nghiên cứu và nghiên cứu chỉ được tiến hành khi đã được sự đồng ý của Lãnh đạo viện Huyết học - Truyền máu Trung ương. Các thông tin của đối tượng nghiên cứu được phê duyệt và giữ bí mật, chỉ nhằm mục đích nghiên cứu.
Nghiên cứu nhằm cung cấp cơ sở khoa học cho việc quản lý, điều trị bệnh, bảo vệ và nâng cao sức khỏe cho bệnh nhân mà khơng nhằm mục đích nào khác.
Lê Xuân Thịnh K24 - Sinh học
Các thông tin của các bệnh nhân chỉ thông báo cho bệnh nhân. Việc thông tin phải được sự đồng ý của bệnh nhân, sẵn sàng tư vấn cho bệnh nhân sau khi nghiên cứu nếu bệnh nhân yêu cầu.
Báo cáo lại kết quả nghiên cứu cho Lãnh đạo Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương.
Lê Xuân Thịnh K24 - Sinh học
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Đặc điểm chung của đối tƣợng nghiên cứu 3.1. Đặc điểm chung của đối tƣợng nghiên cứu
3.1.1. Đặc điểm đối tượng bệnh nhân
Thalassemia là bệnh di truyền phổ biến nhất trên thế giới, bệnh biểu hiện thiếu máu, vàng da, quá tải sắt và nhiều biến chứng. Bố mẹ mang gen bệnh thì có thể sinh con bị bệnh, khi bị bệnh đồng nghĩa với việc điều trị suốt đời bằng truyền máu và thải sắt, chi phí tốn kém sẽ ảnh hưởng rất nhiều đến kinh tế gia đình gây gánh nặng cho gia đình và tồn xã hội, ảnh hưởng tới chất lượng giống nòi. Hiện nay ghép tế bào