Chƣơng 2 : NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.2. Các bước tiến hành nghiên cứu
2.3.2.1. Xác định HLA của bệnh nhân và người hiến cùng huyết thống
Các trường hợp có chỉ định chọc hút dịch ối được chọc dịch ối tại Trung tâm Mô phôi của Học viện Quân y 103, sau khi đã hội chẩn sản khoa đủ điều kiện chọc ối. Q trình ni cấy tế bào dịch ối được thực hiện tại khoa Di truyền sinh học phân tử, Viện Huyết học - Truyền máu TW.
Tách ADN
ADN được tách chiết từ mẫu máu bệnh nhân thalassemia, dịch tế bào ối và máu dây rốn bằng kít tách ADN Omega. Quy trình gồm các bước chính như sau: Hút 250 µl máu bệnh phẩm cho vào ống eppendorf 1,5 ml; thêm 25 µl OB Protease và 250 µl đệm BL vào ống eppendorf, trộn đều và ủ 10 phút ở 65o
C; thêm 260µl cồn 100%, trộn đều trong 20 giây và ly tâm nhanh; chuyển hỗn hợp lên cột. ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch; chuyển cột sang ống mới, bổ sung 500 µl đệm HBC, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch, thấm miệng ống; thêm 700 µl
Lê Xuân Thịnh K24 - Sinh học
Wash Buffer, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 3 phút, bỏ dịch, thấm miệng ống. lặp lại bước này 2 lần; ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút để loại bỏ sạch Wash Buffer; chuyển cột sang ống eppendorf 1.5 ml mới. thêm 200 µl đệm EB, ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng và ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ cột, thu dịch chứa ADN và bảo quản ở -20oC.
Xác định HLA [33]
Xét nghiệm HLA bằng kỹ thuật PCR-SSO (Polymerase chain reaction- Sequence Specific Oligonucleotide) độ phân giải cao trên hệ thống Luminex.
Nguyên lý, kỹ thuật này gồm các bước: tách và ủ DNA của mẫu với đoạn mồi đặc hiệu tương ứng các gen HLA; khuếch đại các gen này bằng PCR; lai sản phẩm PCR với các đoạn đầu dò DNA đặc hiệu của các locus HLA ở độ phân giải cao đã biết và đồng thời mỗi loại hạt cịn được mã hóa riêng bằng màu laser; chạy mẫu và phân tích mẫu trên hệ thống Luminex để xác định HLA của mẫu.
Bước 1: Bước khuếch đại
Ủ ADN của mẫu với đoạn mồi đặc hiệu;
Chạy máy PCR theo chu trình: Biến tính lần đầu: 95oC trong 3 phút; lặp lại 12 chu kỳ (biến tính: 95oC trong 15 giây, gắn mồi: 60oC trong 30 giây, tổng hợp: 72oC trong 30 giây, tổng hợp bước cuối: 72oC trong 5 phút); lặp lại 28 chu kỳ (biến tính: 95oC trong 10 giây, gắn mồi: 63oC trong 30 giây, tổng hợp: 72oC trong 30 giây); tổng hợp bước cuối cùng: 72oC trong 2 phút; duy trì ở 4oC; Thu sản phẩm sau PCR.
Bước 2: Lai
Ủ sản phẩm PCR với hạt bead gắn với đầu dò;
Lai trên máy ủ nhiệt theo chu trình: Biến tính: 95oC trong 2 phút; gắn mồi: 47oC trong 10 phút; tổng hợp: 56oC trong 8 phút; Giữ ở 56oC;
Lê Xuân Thịnh K24 - Sinh học
Pha sẵn dung dịch huỳnh quang PE;
Ủ sản phẩm lai với dung dịch huỳnh quang; Thu sản phẩm sau ủ.
Bước 4: Phân tích kết quả trên máy:
Chạy mẫu trên hệ thống Luminex theo chương trình tự động; Phân tích kết quả sau chạy mẫu.
Hình 1.11. Phần mềm phân tích kết quả xác định alen của HLA
Kết quả minh họa locus A Hình 1.11 cho thấy rằng từ biểu đồ các tín hiệu của các đầu dị locus A (1), phần mềm sẽ lựu chọn các đầu dò locus A có tín hiệu dương tính (2), tiếp theo là đưa ra những gợi ý kết quả của locus A (3) và cuối cùng là tổng hợp kết quả của HLA-A (4).
Sự hòa hợp HLA giữa người hiến và người nhận: được mơ tả mức độ hịa hợp sử dụng 3 locus/(6 alen); người hiến mà có 1 bất đồng HLA được coi như là hịa hợp 5/6; người hiến mà có 2 bất đồng HLA được coi như là hòa hợp 4/6; nếu hịa hợp hồn tồn là 6/6. Trong đó yêu cầu tối thiểu HLA-A và HLA-B ở độ
Lê Xuân Thịnh K24 - Sinh học
phân giải thấp (mức độ kháng nguyên) và HLA-DRB1 ở độ phân giải cao tương đương với mức độ alen.
2.3.2.2. Xác định các chỉ số của đơn vị máu dây rốn cộng đồng
Xác định HLA của các đơn vị máu dây rốn cộng đồng được thực hiện theo quy trình như xác định HLA cho bệnh nhân và người hiến cùng huyết thống. Ngoài ra các đơn vị máu dây rốn cộng đồng còn được thực hiện các xét nghiệm đếm số lượng CD34+, đếm tế bào có nhân (TBCN), xác định nhóm máu để phục vụ cho việc tìm kiếm đơn vị tế bào gốc hịa hợp cho bệnh nhân.
2.3.2.3. Tìm kiếm người hiến hịa hợp cho bệnh nhân
- Tìm kiếm người hiến cùng huyết thống hịa hợp HLA với bệnh nhân;
- Tìm kiếm người hiến khơng cùng huyết thống hòa hợp HLA cho những bệnh nhân khơng có người hiến hoặc có người hiến cùng huyết thống nhưng khơng hịa hợp HLA.
Xác định HLA bằng kỹ thuật PCR-SSO
Hòa hợp HLA 21 bệnh nhân
Khơng hịa hợp HLA 37 bệnh nhân Xác định HLA bằng kỹ thuật PCR-SSO Xác định HLA bằng kỹ thuật PCR-SSO Đánh giá Hòa hợp HLA Thu thập, lƣu trữ TBG 59 BN tìm kiếm TBG MDRCĐ Lựa chọn đơn vị TBG phù hợp Chuẩn bị ghép 58 Ngƣời hiến cùng huyết thống 58 BN có ngƣời hiến cùng huyết thống 22 BN khơng có ngƣời hiến cùng huyết thống 80 Bệnh nhân thalassamia có chỉ định ghép
Lê Xuân Thịnh K24 - Sinh học