Chƣơng 2 : ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.4. Đánh giá kết quả bảo quản lạnh sâu van tim
Chỉ tiêu đánh giá chất lƣợng van tim bao gồm các chỉ tiêu về vô khuẩn, biến đổi cấu trúc, hình thái, khả năng sống của tế bào, chủ yếu nguyên bào sợi - thành phần chính sản xuất collagen.
a. Các chỉ tiêu đánh giá về độ vô khuẩn sau rã đông
- Cấy kiểm tra vi khuẩn 100% âm tính
b. Các chỉ tiêu đánh giá hình thái, cấu trúc (đại thể, vi thể, siêu vi thể)
- Tình trạng tồn vẹn mẫu mô: nguyên vẹn, rách, nứt, vỡ, … - Màu sắc
Dựa vào chỉ tiêu đánh giá hình thái vi thể, siêu vi thể, khả năng sống tế bào mô van tim trong nghiên cứu của Rendal Vázquez (2004) và Quintana (2009) [66], chúng tôi đƣa ra các chỉ tiêu đánh giá nhƣ sau:
- Các chỉ tiêu đánh giá hình thái vi thể:
+ Mơ van tim: nguyên vẹn, rách, nứt, gãy, vỡ…
+ Lớp tế bào nội mơ: liên tục, bong tách ít (<50% chiều dài nội mơ): (+); bong tách nhiều (>50% chiều dài nội mô): (-).
+ Nguyên bào sợi: số lƣợng vài tế bào (+), trung bình (++), nhiều (+++) so với mẫu mơ tƣơi.
+ Phù nề mơ kẽ: có hoặc khơng (+/-).
+ Sắp xếp các sợi collagen mềm mại, liên tục, song song với nhau (+/-)
c. Các chỉ tiêu đánh giá khả năng sống của tế bào
So sánh khả năng sống nguyên bào sợi mô van tim lợn trƣớc và sau bảo quản lạnh sâu, 3 tháng và 6 tháng với nhau.
2.2.3.3. Các kỹ thuật sử dụng nghiên cứu
a. Kỹ thuật làm tiêu bản nhuộm Hematoxylin-Eosin (H.E)
- Mục đích: quan sát cấu trúc hình thái ở mức vi thể mơ van tim - Quy trình:
Mẫu mô đƣợc cố định bằng dung dịch Bouin
Khử nƣớc bằng cồn có nồng độ tăng dần
Làm trong miếng mô bằng Toluen
Đúc đứng miếng mô trong khuôn nến riêng và đánh số thứ tự
Cắt mẫu thành các những lát mỏng 4 µm
Tiêu bản đƣợc quan sát trên kính hiển vi quang học và chụp ảnh ở độ phóng đại 250x, 500x và 100x
- Nhận xét sự biến đổi hình thái và cấu trúc mô van tim
b. Kỹ thuật làm tiêu bản nhuộm 3 màu theo Masson
- Mục đích: quan sát rõ thành phần mô liên kết, cụ thể là sợi collagen ở mơ van tim.
- Quy trình:
Mẩu mô đƣợc cố định bằng dung dịch Formalin 10%.
Khử nƣớc bằng cồn có nồng độ tăng dần.
Làm trong miếng mô bằng Toluen.
Đúc đứng miếng mô trong khuôn nến riêng và đánh số thứ tự.
Cắt mẫu thành các những lát mỏng 4 µm.
Nhuộm màu lát cắt bằng dung dịch nhuộm theo phƣơng pháp 3 màu của Masson , dán lamelle.
Tiêu bản đƣợc quan sát trên kính hiển vi quang học và chụp ảnh ở độ phóng đại 100x, 250x và 1000x.
Lên kính.
- Nhận xét về sự cấu trúc và sự sắp xếp sợi collagen trong mô van tim
c. Kỹ thuật làm tiêu bản hiển vi điện tử truyền qua.
- Mục đích: đánh giá siêu cấu trúc các lớp và hình ảnh 3 chiều mơ van tim - Quy trình:
Cố định mẫu mô van tim trong dung dịch glutaraldehyde 3% trong 3 giờ. Sau đó cố định trong acid osmic, rửa trong dung dịch poalat.
Khử nƣớc bằng dung dịch cồn có nồng độ tăng dần.
Sau đó đặt trong propylenoxid và tẩm đúc bằng hỗn hợp đúc.
Nhuộm mẫu bệnh phẩm trong dung dịch uranyl acetat (phƣơng pháp reynolds).
Quan sát mẫu bệnh phẩm dƣới kính hiển vi điện tử truyền qua, độ phóng đại 800- 30000 lần.
- Nhận xét hình thái, cấu trúc tế bào mô van tim.
d. Kỹ thuật làm tiêu bản nhuộm Trypan Blue.
- Mục đích: đánh giá sự sống chết của tế bào mô van tim - Quy trình:
Lá van tim đƣợc cho vào trong môi trƣờng RPMI – 1640
Thêm 0,5% collagenase type II và ủ ở 37⁰C trong 5 phút
Rửa toàn bộ lá van trong dung dịch PBS
Tiếp tục cho lá van tim vào môi trƣờng RPMI – 1640 và 0,5% collagenase type II và ủ ở 37⁰C trong 30 phút
Hịa lỗng trong mơi trƣờng RPMI – 1640 và ly tâm ở 300 rpm trong 5 phút
Hút bỏ môi trƣờng ở trên, và cho thêm môi trƣờng RPMI – 1640, ly tâm lại ở 1000 rpm trong 5 phút
Phần thu đƣợc lấy 50 µl (2x 100.000 – 1000.000 tế bào/ml) nhuộm với 0,4% trypan blue
Soi dƣới kính hiển vi quang học và đếm trên buồng đếm tế bào máu
2.2.3.4. Xử lý số liệu
Số liệu đƣợc nghiên cứu, mã hóa, nhập, xử lý và phân tích trên máy tính, sử dụng phần mềm SPSS 20.0.
So sánh, kiểm định sự khác biệt của các biến định lƣợng giữa hai nhóm bằng test χ², các so sánh có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.