ĐỐI TƢỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊNCỨU

Chƣơng 2 : ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU

2.1. ĐỐI TƢỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊNCỨU

Đối tƣợng nghiên cứu: 45 lá van lấy từ 15 van động mạch chủ lợn thực

nghiệm, là giống lợn lai kinh tế từ 5 - 6 tháng tuổi, trọng lƣợng 90 - 100 kg, khơng kể giới tính, khỏe mạnh.

Địa điểm nghiên cứu: đƣợc tiến hành tại Labo công nghệ mô ghép - Trƣờng đại học Y Hà Nội.

Thời gian nghiên cứu: nghiên cứu đƣợc tiến hành từ 1/2017 đến

10/2017.

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu thực nghiệm, mơ tả có đối chứng.

2.2.1. Phân nhóm nghiên cứu

45 lá van chia thành 3 nhóm. Nhóm 1: khơng bảo quản Nhóm 2: bảo quản 3 tháng Nhóm 3: bảo quản 6 tháng

2.2.2. Thiết kế thí nghiệm

Các bước để thực hiện nghiên cứu này được trình bày trong hình 2.1.

Hình 2.1. Sơ đồ mơ hình nghiên cứu

2.2.3. Phƣơng pháp, kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu

2.2.3.1. Lấy mẫu van tim

- 45 lá van đƣợc lấy từ van động mạch chủ lợn khỏe mạnh, có đăng ký trƣớc với chủ lị mổ để đảm bảo vệ sinh, khơng cho ăn một ngày trƣớc khi giết mổ. Qui trình lấy van tim đƣợc tiến hành nhƣ sau: Lợn đƣợc làm sạch vùng ngực, sát trùng, mở thông vùng ngực, dùng dao giết lợn thơng thƣờng lấy tồn bộ quả tim và các cuống mạch lớn. Chú ý thao tác nhanh để đảm bảo tim lấy ra cịn nóng. Ngâm ngay vào dung dịch sinh lý có pha kháng sinh, chuyển nhanh về lab. Bảo quản mơ để phẫu tích lấy van động mạch chủ.

45 lá van động mạch chủ lợn

Nhóm chứng khơng bảo quản

(5 lá van) ( Bảo quản 3 tháng (20 lá van) Bảo quản 6 tháng (20 lá van)

So sánh hình thái đại thể, vi thể, siêu vi thể, khả năng sống của tế bào mô van tim trƣớc và sau bảo quản

Hình 2.2. Lấy một trong ba lá van làm mẫu nghiên cứu

Chỉ tiêu: van lấy trong 10 phút đầu sau khi giết lợn (giai đoạn thiếu máu nóng), trong điều kiện vơ trùng, cịn nóng, cấy kiểm tra vi khuẩn, nấm.

A: Chứng B: Bảo quản 3 tháng C: Bảo quản 6 tháng

Hình 2.3. Sơ đồ lấy mẫu lá van tim nghiên cứu

Sau đó tại mỗi lá van lấy:

- 1 mẫu để làm tiêu bản nhuộm H.E và Masson đánh giá cấu trúc vi thể chung của mô (tế bào, sợi)

- 1 mẫu làm tiêu bản hiển vi điện tử xuyên (TEM) đánh giá siêu cấu trúc - 1 mẫu nhuộm Trypan Blue để đánh giá chất lƣợng sống của tế bào mô van tim.

2.2.3.2. Xử lý và bảo quản lạnh sâu van tim a. Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất mơi trường

- Bộ dụng cụ: kéo cong, kéo thẳng, nỉa cong không mấu, nỉa thẳng không mấu - Bát to (dung tích trên 3000ml)

- Hộp chuyên dụng để giữ, bảo quản và vận chuyển van tim - Săng, quần áo mổ vô trùng, găng, gạc vô trùng

- Hóa chất xử lý van tim: nƣớc muối sinh lý, RPMI 1640, kháng sinh vancomycin, amikacin, amphotericin B

- Hóa chất bảo quản lạnh sâu van tim: RPMI 1640, DMSO, FBS, penicillin, streptomycin, amphotericin B.

b. Xử lý van tim trước bảo quản

- Rửa van tim nhiều lần bằng dung dịch nƣớc muối đẳng trƣơng

- Ngâm van trong dung dịch RPMI 1640 có bổ sung hỗn hợp kháng sinh vancomycin 50 µg/ml, amikacin 100 µg/ml, amphotericin B 20 µg/ml ở 4oC trong 24 tiếng. Mức dịch đảm bảo ngập tồn bộ mơ.

- Rửa lại mô bằng nƣớc muối đẳng trƣơng lạnh vô khuẩn

c. Kiểm tra độ vô khuẩn van tim trước khi đưa vào bảo quản

Xét nghiệm vi sinh mẫu bằng cách cấy trên thạch máu tìm vi khuẩn, nấm.

d. Đưa vào môi trường chứa chất bảo quản

Van tim sau khi xử lý đƣợc thả vào dung dịch bảo quản lạnh bao gồm: môi trƣờng RPMI 1640 lạnh 4oC có bổ sung hỗn hợp kháng sinh penicilin 10.000UI/ml, streptomycin 10.000 µg/ml, Amphotericin B 0,125 µg/ml và DMSO là chất bảo vệ lạnh, bổ sung thêm 10% FBS. Việc bổ sung DMSO vào dung dịch bảo quản lạnh đƣợc tiến hành qua 4 bƣớc với nồng độ tăng dần: 2,5%, 5%, 7,5%, 10%. Mỗi nồng độ lƣu trong thời gian 5 phút. Tổng thời gian mô ủ với dung dịch bảo quản lạnh ở điều kiện 4oC là 20 phút.

Toàn bộ van tim và chất bảo quản đƣợc chứa trong túi nhựa, bên ngồi là túi thiếc. Mơ van tim phải nằm giữa dung dịch bảo quản, không đƣợc chạm vào thành túi.

e. Hạ nhiệt độ theo chương trình

Đƣa túi chứa van tim và dung dịch bảo quản vào máy hạ nhiệt độ theo chƣơng trình. Tốc độ hạ nhiệt trung bình -1oC/phút tới nhiệt độ của thiết bị bảo quản.

f. Bảo quản lạnh sâu van tim

Đƣa túi chứa van tim và dung dịch bảo quản sau khi hạ nhiệt độ vào bảo quản lâu dài tại mức nhiệt độ: -80 oC bằng máy lạnh cơ học. (tủ lạnh sâu).

Theo dõi sự ổn định của nhiệt độ trên bảng tự động cài sẵn.

g. Rã đông van tim

Định kỳ sau 3 tháng, 6 tháng, mô đƣợc rã đông để đánh giá chất lƣợng. Sử dụng kỹ thuật rã đông nhanh bằng cách: Mô bảo quản lấy ra khỏi hơi nitơ đƣợc dìm trong bể nƣớc điều nhiệt đƣợc duy trì 37oC cho tới khi tan đá hồn tồn.

- Mơ sau khi đã rã đông sẽ đƣợc loại bỏ dung dịch bảo quản lạnh chứa chất bảo vệ lạnh bằng cách rửa trong các dung dich có nồng độ DMSO giảm dần (7,5%, 5%, 2,5% và 0 %). Mỗi nồng độ rửa trong 5 phút. Tổng thời gian để loại bỏ DMSO là 20 phút.

2.2.4. Đánh giá kết quả bảo quản lạnh sâu van tim

Chỉ tiêu đánh giá chất lƣợng van tim bao gồm các chỉ tiêu về vô khuẩn, biến đổi cấu trúc, hình thái, khả năng sống của tế bào, chủ yếu nguyên bào sợi - thành phần chính sản xuất collagen.

a. Các chỉ tiêu đánh giá về độ vô khuẩn sau rã đông

- Cấy kiểm tra vi khuẩn 100% âm tính

b. Các chỉ tiêu đánh giá hình thái, cấu trúc (đại thể, vi thể, siêu vi thể)

- Tình trạng tồn vẹn mẫu mô: nguyên vẹn, rách, nứt, vỡ, … - Màu sắc

Dựa vào chỉ tiêu đánh giá hình thái vi thể, siêu vi thể, khả năng sống tế bào mô van tim trong nghiên cứu của Rendal Vázquez (2004) và Quintana (2009) [66], chúng tôi đƣa ra các chỉ tiêu đánh giá nhƣ sau:

- Các chỉ tiêu đánh giá hình thái vi thể:

+ Mô van tim: nguyên vẹn, rách, nứt, gãy, vỡ…

+ Lớp tế bào nội mô: liên tục, bong tách ít (<50% chiều dài nội mơ): (+); bong tách nhiều (>50% chiều dài nội mô): (-).

+ Nguyên bào sợi: số lƣợng vài tế bào (+), trung bình (++), nhiều (+++) so với mẫu mơ tƣơi.

+ Phù nề mơ kẽ: có hoặc khơng (+/-).

+ Sắp xếp các sợi collagen mềm mại, liên tục, song song với nhau (+/-)

c. Các chỉ tiêu đánh giá khả năng sống của tế bào

So sánh khả năng sống nguyên bào sợi mô van tim lợn trƣớc và sau bảo quản lạnh sâu, 3 tháng và 6 tháng với nhau.

2.2.3.3. Các kỹ thuật sử dụng nghiên cứu

a. Kỹ thuật làm tiêu bản nhuộm Hematoxylin-Eosin (H.E)

- Mục đích: quan sát cấu trúc hình thái ở mức vi thể mơ van tim - Quy trình:

 Mẫu mơ đƣợc cố định bằng dung dịch Bouin

 Khử nƣớc bằng cồn có nồng độ tăng dần

 Làm trong miếng mô bằng Toluen

 Đúc đứng miếng mô trong khuôn nến riêng và đánh số thứ tự

 Cắt mẫu thành các những lát mỏng 4 µm

 Tiêu bản đƣợc quan sát trên kính hiển vi quang học và chụp ảnh ở độ phóng đại 250x, 500x và 100x

- Nhận xét sự biến đổi hình thái và cấu trúc mô van tim

b. Kỹ thuật làm tiêu bản nhuộm 3 màu theo Masson

- Mục đích: quan sát rõ thành phần mơ liên kết, cụ thể là sợi collagen ở mô van tim.

- Quy trình:

 Mẩu mơ đƣợc cố định bằng dung dịch Formalin 10%.

 Khử nƣớc bằng cồn có nồng độ tăng dần.

 Làm trong miếng mô bằng Toluen.

 Đúc đứng miếng mô trong khuôn nến riêng và đánh số thứ tự.

 Cắt mẫu thành các những lát mỏng 4 µm.

 Nhuộm màu lát cắt bằng dung dịch nhuộm theo phƣơng pháp 3 màu của Masson , dán lamelle.

 Tiêu bản đƣợc quan sát trên kính hiển vi quang học và chụp ảnh ở độ phóng đại 100x, 250x và 1000x.

 Lên kính.

- Nhận xét về sự cấu trúc và sự sắp xếp sợi collagen trong mô van tim

c. Kỹ thuật làm tiêu bản hiển vi điện tử truyền qua.

- Mục đích: đánh giá siêu cấu trúc các lớp và hình ảnh 3 chiều mơ van tim - Quy trình:

 Cố định mẫu mơ van tim trong dung dịch glutaraldehyde 3% trong 3 giờ. Sau đó cố định trong acid osmic, rửa trong dung dịch poalat.

 Khử nƣớc bằng dung dịch cồn có nồng độ tăng dần.

 Sau đó đặt trong propylenoxid và tẩm đúc bằng hỗn hợp đúc.

 Nhuộm mẫu bệnh phẩm trong dung dịch uranyl acetat (phƣơng pháp reynolds).

 Quan sát mẫu bệnh phẩm dƣới kính hiển vi điện tử truyền qua, độ phóng đại 800- 30000 lần.

- Nhận xét hình thái, cấu trúc tế bào mô van tim.

d. Kỹ thuật làm tiêu bản nhuộm Trypan Blue.

- Mục đích: đánh giá sự sống chết của tế bào mơ van tim - Quy trình:

 Lá van tim đƣợc cho vào trong môi trƣờng RPMI – 1640

 Thêm 0,5% collagenase type II và ủ ở 37⁰C trong 5 phút

 Rửa toàn bộ lá van trong dung dịch PBS

 Tiếp tục cho lá van tim vào môi trƣờng RPMI – 1640 và 0,5% collagenase type II và ủ ở 37⁰C trong 30 phút

 Hịa lỗng trong mơi trƣờng RPMI – 1640 và ly tâm ở 300 rpm trong 5 phút

 Hút bỏ môi trƣờng ở trên, và cho thêm môi trƣờng RPMI – 1640, ly tâm lại ở 1000 rpm trong 5 phút

 Phần thu đƣợc lấy 50 µl (2x 100.000 – 1000.000 tế bào/ml) nhuộm với 0,4% trypan blue

 Soi dƣới kính hiển vi quang học và đếm trên buồng đếm tế bào máu

2.2.3.4. Xử lý số liệu

Số liệu đƣợc nghiên cứu, mã hóa, nhập, xử lý và phân tích trên máy tính, sử dụng phần mềm SPSS 20.0.

So sánh, kiểm định sự khác biệt của các biến định lƣợng giữa hai nhóm bằng test χ², các so sánh có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.

2.2.5. Đạo đức trong nghiên cứu

Nghiên cứu đƣợc thực hiện hoàn toàn trên động vật. Tuy nhiên hạn chế giết mổ tối đa.

Chƣơng 3

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. KẾT QUẢ ỨNG DỤNG QUY TRÌNH BẢO QUẢN VAN TIM TRÊN THỰC NGHIỆM THỰC NGHIỆM

Chúng tôi lựa chọn nghiên cứu trên van tim lợn bởi sự sẵn có và rẻ tiền của nó so với các loại van động vật khác, cũng nhƣ có nhiều nghiên cứu đã tiến hành trên van tim lợn để chúng tôi so sánh. Ở các nƣớc phát triển, những nghiên cứu về phƣơng pháp bảo quản lạnh trên đối tƣợng là van tim ngƣời từ nguồn hiến tạng có từ rất lâu đời. Nhƣng tại Việt Nam, van tim từ ngƣời hiến tạng vẫn cịn rất khan hiếm, khơng có sẵn. Trong tƣơng lai đây cũng là đích nghiên cứu của phƣơng pháp bảo quản lạnh trong bảo quản mơ ghép van đồng lồi khi số lƣợng ngƣời hiến tạng của chúng ta phát triển nhƣ thế giới. Các mẫu van tim chúng tôi sử dụng đƣợc lấy trên những lợn khỏe mạnh có độ tuổi và cân nặng tƣơng đƣơng nhau, không kể đực, cái để thuận tiện cho việc so sánh và đánh giá mẫu nghiên cứu.

Quy trình bảo quản lạnh sâu của chúng tơi đƣợc thực hiện dựa trên cơ sở kỹ thuật hiên đại trong bảo quản mô tế bào. Các bƣớc đƣợc chúng tôi tiến hành đã đƣợc một số tác giả sử dụng và chứng minh về hiệu quả sau bảo quản. Sau khi xây dựng các chỉ tiêu, chúng tôi tiến hành nghiên cứu theo qui trình bảo quản mơ van tim của lab. Cơng nghệ mô ghép - Đại học y Hà Nội. Qui trình gồm 4 bƣớc chính: lấy mơ, kiểm tra vi khuẩn, xử lý mô, bảo quản mô, đánh giá chất lƣợng mơ sau bảo quản theo qui trình ở các thời điểm khác nhau.

3.1.1. Kết quả lấy mẫu nghiên cứu

Mỗi mẫu nghiên cứu là 1 lá van lấy từ van động mạch chủ. Mẫu chỉ đƣợc tính sau khi lấy van tim hồn chỉnh. Có hai giai đoạn: lấy van tim trực tiếp trên lợn và phẫu tích lấy các lá van. Mỗi van lấy 3 lá van, mỗi lá van là một mẫu. Van tim đƣợc lấy trực tiếp từ lợn theo đúng qui trình, nội dung các bƣớc đƣợc thể hiện ở bảng 3.1.

Bảng 3.1. Kết quả kiểm tra quy trình lấy van tim.

STT Nội dung qui trình Số van tim

1 Thời gian thiếu máu nóng 15

2 Sát khuẩn dụng cụ 15

3 Sát khuẩn vùng da 15

4 Chuẩn bị dung dịch ngâm mẫu 15

5 Vị trí chọc đúng gây chết và khơng tổn

thƣơng van tim (đợt 1) 12/15

6 Vị trí chọc đúng gây chết và không tổn

thƣơng van tim (đợt 2 - bổ sung) 3/3 7 Kiểm tra, lựa chọn tiêu chuẩn van tim

(cịn nóng, giật cơ, máu chƣa đông) 15 8 Tổng số van tim lấy đủ tiêu chuẩn 45

Tổng số van tim (chỉ lấy van động mạch chủ) theo dự kiến phải lấy là 15, tuy nhiên có 3 trƣờng hợp sau khi phẫu tích lấy mẫu khơng đạt u cầu vì bị rách do quá trình giết nên phải loại bỏ và bổ sung thêm cho đủ 15 ở đợt mổ thứ hai. Sau khi lấy và kiểm tra các van tim cịn ngun vẹn, tiến hành phẫu tích lấy các lá van. Mỗi van lấy 3 lá van, mỗi lá van là một mẫu nghiên cứu. Chúng tôi lấy đủ 45 mẫu nghiên cứu sau 2 đợt.

Trong việc lấy mẫu nghiên cứu, thời gian từ khi tim ngừng đập đến khi van tim đƣợc bảo quản có ý nghĩa rất lớn đến chất lƣợng mơ van tim sau bảo quản. Hai khái niệm cần chú ý đó là: thời gian thiếu máu nóng là thời gian từ khi tim ngừng đập để ở nhiệt độ phòng đến khi van tim đƣợc bảo quản và thời gian thiếu máu lạnh là thời gian tim ngừng đập nhƣng đƣợc giữ tạm thời ở nhiệt độ lạnh 4°C. Thời gian thiếu máu càng kéo dài, càng dễ gây ra những tổn hại đến khả năng sống của tế bào cũng nhƣ các thành phần ngoại bào. Đó là yếu tố quan trọng để duy trì chức năng van lâu dài ảnh hƣởng trực tiếp đến tuổi thọ van tim sau ghép [5]. Nghiên cứu của Suh H (1999) đánh giá tác động của thời gian thiếu máu nóng và thiếu máu lạnh lên khả năng sống của nguyên bào sợi thu đƣợc kết quả tỷ lệ sống nguyên bào sợi sau 2 giờ thiếu máu nóng là 92,25 ± 2,7%, sau 12 giờ là 84,9 ± 6,7%, sau 24 giờ là 57,0 ± 10,2% và sau 36 giờ là 55,9 ± 7,9%; khả năng sống nguyên bào sợi sau thời gian thiếu máu lạnh trên 24 giờ giảm hơn so với thời gian thiếu máu lạnh trong 24 giờ, khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) [78]. Ngoài ra tác giả đƣa ra khẳng định thời gian thiếu máu nóng có ý nghĩa quan trọng hơn thời gian thiếu máu lạnh trong việc ảnh hƣởng đến khả năng sống nguyên bào sợi và nên trong khoảng 12 giờ trở lại. Bởi vậy, các ngân hàng mô đều quy định thời gian thiếu máu nóng tối đa khơng q 12 giờ, thời gian thiếu máu lạnh tối đa là 24 giờ [5, 29, 84, 86, 90].

Trong nghiên cứu của chúng tơi, tim lợn vẫn cịn đập và đƣợc lấy ngay khi thợ mổ mở lồng ngực của lợn, rồi rửa sạch bằng dung dịch nƣớc muối đẳng trƣơng để loại bỏ sạch máu, tránh tình trạng hình thành cục máu đơng, có thể là cơ sở gây nhiễm khuẩn cho mơ van tim ghép. Sau đó, tim đƣợc đóng gói vơ trùng chứa dung dịch nƣớc muối đẳng trƣơng, bảo quản tạm thời ở điều kiện 4°C trong hộp chuyên dụng chuyển về Labo để phẫu tích lấy van tim và tiến hành bảo quản ngay. Thời gian vận chuyển tim từ lò mổ về Labo nhỏ hơn 1 giờ. Tại Labo, các dụng cụ, hóa chất để xử lý và bảo quản van tim đã đƣợc chuẩn bị sẵn. Tổng thời gian van tim thiếu máu nóng của chúng tơi khống chế nhỏ hơn 6 giờ, đảm bảo đƣợc yêu cầu bảo quản.

3.1.2. Kết quả thực hiện qui trình xử lý và bảo quản van tim