Hóa chất Nồng độ (%) Thời gian (phút) Số mẫu Tỷ lệ (%) mẫu nhiễm chết sống HgCl2 0,025 5 30 16,7 0,0 83,3 10 30 10,0 0,0 90,0 0,05 5 30 0,0 0,0 100,0 10 30 0,0 16,7 83,3 0,075 5 30 0,0 6,7 93,3 10 30 0,0 33,3 66,7 0,10 5 30 0,0 40,0 60,0 10 30 0,0 43,3 56,7 NaOCl 0,25 5 30 60,0 0,0 40,0 10 30 36,7 0,0 63,3 0,50 5 30 20,0 0,0 80,0 10 30 0,0 0,0 100,0 0,75 5 30 0,0 0,0 100,0 10 30 0,0 0,0 100,0 1,00 5 30 0,0 0,0 100,0
Các hạt dưa hấu đã bóc vỏ dễ bị tổn thương trước hóa chất khử trùng có độc tính cao như HgCl2. Vì bao bọc trong vỏ hạt nên những hạt đã bóc vỏ thường có mật độ vi sinh vật thấp hơn, do đó chúng tơi đã sử dụng dung dịch NaOCl có mức độc tính thấp cho quá trình khử trùng. Bảng 3 đã cho thấy ở nồng độ NaOCl là 0,25%, tỷ lệ mẫu sống thu được là 36,7 và 53,3% tương ứng với thời gian khử trùng là 5 và 10 phút. Với thời gian khử trùng mẫu là 5 phút ở nồng độ NaOCl 0,50 và 0,75% đã có thể loại bỏ hồn tồn các vi sinh vật và cho tỷ lệ mẫu sống đã đạt tới 100%. Như vậy, có thể khẳng định dung dịch NaOCl có nồng độ từ 0,5% trở lên là dung dịch phù hợp cho quá trình khử trùng hạt dưa hấu đã bóc vỏ, đồng thời đảm bảo sự an tồn cho mơi trường cũng như người tiến hành thí nghiệm.
Bảng 3.2 Kết quả khử trùng hạt dưa hấu đã bóc vỏ
Hóa chất Nồng độ (%) Thời gian (phút) Số mẫu Tỷ lệ (%)
mẫu nhiễm mẫu chết mẫu sống
NaOCl 0,25 5 30 70 0 36,7 10 30 60 0 53,3 0,50 5 30 0 0 100 10 30 0 0 100 0,75 5 30 0 0 100 10 30 0 0 100 1, 00 5 30 0 0 100 10 30 0 0 100
3.2. Kết quả tạo mô sẹo của mẫu dƣa hấu
Mơ sẹo là khối các tế bào chưa phân hóa về cấu trúc và chức năng, thường được hình thành do tác dụng của các chất thuộc nhóm auxin. Trong đó 2,4D là auxin được dùng phổ biến cho q trình hình thành mơ sẹo của nhiều loài thực vật. Những nghiên cứu trước đây đã cho thấy mơ sẹo dưa hấu được hình thành do 2,4D khơng thể tái sinh thành chồi. Vì vậy, để khảo sát sự hình thành mơ sẹo đồng thời có thể thu nhận chồi tái sinh từ mơ sẹo, chúng tôi đã sử dụng NAA thay cho 2,4D.
Từ các hạt dưa hấu nảy mầm được 1 tuần tuổi, các lá mầm được tách rời ra và cắt thành các mảnh nhỏ có kích thước khoảng 0,5 x 0,5 cm và sau đó được cấy vào các mơi trường cảm ứng hình thành mơ sẹo. Mơi trường đối chứng C0 có thành phần như sau:
C0: MS + 30 g/l đường + 50 ml/l nước dừa + 7 g/l agar
Các mơi trường thí nghiệm C1, C2, C3, C4 đều có thành phần giống với mơi trường đối chứng nhưng có bổ sung thêm phytohormone NAA ở các nồng độ tương ứng: 0,5 mg/l; 1,0 mg/l; 1,5 mg/l; 2,0 mg/l. Các bình ni cấy đều được ni trong điều kiện khơng có ánh sáng để kích thích q trình hình thành mơ sẹo. Trong quá trình theo dõi sự hình thành mơ sẹo, chúng tôi nhận thấy: khi nuôi cấy được 3-4 ngày, các lá mầm có hiện tượng trương lên. Sau đó khoảng 2 tuần trên các mơi trường có bổ sung NAA bắt đầu xuất hiện những hình cầu nhỏ màu trắng ở viền của lá mầm, nơi bị cắt và tiếp xúc với môi trường. Tiếp theo, những lá mầm đó có xu thế hình thành mơ sẹo, từ vết cắt lan dần vào trung tâm của mảnh lá mầm. Ở môi trường đối chứng C0, mảnh lá mầm có tăng lên về kích thước nhưng hồn tồn khơng hình thành mơ sẹo.
Sau 3 tuần ni cấy trong tối, các mơi trường C1, C2, C3 và C4 đều có hình thành mơ sẹo, đã cho thấy NAA là thành phần cần thiết trong kích thích tạo mô sẹo ở mẫu dưa hấu nuôi cấy. Tiếp tục nuôi thêm 3 tuần nữa, mơ sẹo có các cấu trúc đồng đều nhất và có màu vàng hình thành trên mảnh lá mầm là ở mơi trường C2 (có chứa 1,0 mg/l NAA). Các môi trường C3 (có 1,5 mg/l NAA), C4 (có 2,0 mg/l NAA) cũng có hình thành các khối mơ sẹo rõ rệt nhưng chuyển màu sẫm hơn hoặc không phân bố đều xung quanh vết cắt của mảnh lá mầm (hình 3.1). Nhìn chung mơ sẹo hình thành trên các mơi trường này đều có màu vàng hơi sẫm, với các cấu trúc đặc nhưng khối mơ sẹo có kích thước nhỏ cho thấy mơi trường kích thích hình thành mơ sẹo cần phải bổ sung thêm một hoặc vài thành phần khác để thúc đẩy q trình tạo mơ sẹo dưa hấu in vitro.
Hình 3.1 Kết quả tạo mơ sẹo trên mơi trường chỉ có NAA (sau 6 tuần nuôi cấy)
A: môi trường đối chứng C0; B: môi trường C1; C: môi trường C2; D: môi trường C3; E: môi trường C4.
E
A B
Để làm tăng kích thước khối mô sẹo cần thiết cho các thí nghiệm tái sinh chồi sau này, chúng tôi đã thử nghiệm bổ sung thêm cytokinin (0,5 mg/l BAP) vào các môi trường nuôi cấy. Thành phần của các môi trường này (C5, C6, C7, C8) là tương tự như các môi trường C1, C2, C3, C4 nhưng có thêm 0,5 mg/l BAP. Kết quả sau 3 tuần nuôi cấy trong tối, tất cả các mơi trường có bổ sung NAA và BAP đều hình thành mô sẹo. Tỷ lệ tạo mô sẹo trên các môi trường C5, C6, C7, C8 sau 3 tuần nuôi cấy lần lượt là 65; 87,5; 85,0 và 63,63% trong khi mơi trường đối chứng khơng hình thành mơ sẹo (hình 2). Sau 6 tuần ni cấy, tỷ lệ các mảnh lá mầm tạo mô sẹo ở môi trường C5 là 87,5%, trong khi ở các môi trường C6, C7, C8 tất cả các mảnh lá mầm đều có hình thành mơ sẹo. Cịn trên mơi trường đối chứng, mảnh lá mầm chuyển màu vàng đậm và vẫn khơng hình thành mơ sẹo.
Trên các môi trường C5, C6, C7, C8, khối mô sẹo có kích thước lớn hơn hẳn so với mơ sẹo tạo ra trên mơi trường chỉ có NAA (mơi trường C1, C2, C3, C4) và phát triển bao trùm hoàn tồn mảnh lá mầm. Các khối mơ sẹo trên các mơi trường đều có màu khá giống nhau từ trắng vàng đến vàng nhạt với các khối cấu trúc tơi xốp, chứng tỏ BAP ở nồng độ 0,5 mg/l kết hợp với NAA có tác dụng rõ rệt trong hình thành mơ sẹo dưa hấu. Mơi trường ni cấy không chỉ ảnh hưởng tới tỷ lệ phát sinh mô sẹo mà cịn ảnh hưởng tới chất lượng mơ sẹo, từ đó dẫn tới ảnh hưởng đến khả năng tái sinh chồi. Ở môi trường C6 (1,0 mg/l NAA và 0,5 mg/l BAP) cho tỷ lệ tạo mô sẹo cao nhất là 89,47 và 100% tương ứng với sau 3 và 6 tuần nuôi cấy (bảng 3.3). Đây là các khối mơ sẹo được hình thành trực tiếp từ mẫu cấy lá mầm dưa hấu do vậy có thể dùng làm mẫu để nhân sinh khối mô sẹo hoặc dùng làm vật liệu cho các thí nghiệm tái sinh chồi từ mơ sẹo.
Hình 3.2 Kết quả tạo mơ sẹo trên mơi trường có NAA và BAP (sau 6 tuần nuôi cấy)
A: môi trường đối chứng C0b; B: môi trường C5; C: môi trường C6; D: môi trường C7; E: môi trường C8.
E
A B
Bảng 3.3 Kết quả hình thành mơ sẹo dưa hấu trên mơi trường có NAA và BAP MT MT Nồng độ NAA (mg/l) Số mẫu 3 tuần 6 tuần Tỷ lệ tạo mô sẹo (%)
Đặc điểm mô sẹo
Tỷ lệ tạo mô sẹo
(%)
Đặc điểm mô sẹo
C0b 0 20 0,0 Không tạo mô sẹo 0,0 Không tạo mô sẹo
C5 0,5 20 65,0 Màu trắng sữa, xốp 87,5 Màu trắng vàng, xốp
C6 1,0 20 87,5 Màu trắng sữa, xốp 100,0 Màu trắng vàng, xốp
C7 1,5 20 85,0 Màu trắng sữa, xốp 100,0 Màu trắng vàng, xốp
C8 2,0 20 63,63 Màu trắng sữa, xốp 100,0 Màu trắng vàng, xốp
3.3. Ảnh hƣởng của phytohormone đến tái sinh chồi từ mô sẹo
Để thu nhận được các chồi cây in vitro từ mơ sẹo thì q trình tái sinh chồi cần thực hiện trên mơi trường khơng có auxin. Tuy nhiên, theo tác giả Li và cộng sự (2011), các môi trường tái sinh dưa hấu từ lá mầm có sự phối hợp giữa BAP và 1 loại hormone thuộc nhóm auxin cho kết quả tạo chồi tốt hơn khi dùng BAP riêng rẽ [19]. Do IAA là auxin kém bền nhiệt, sẽ bị giảm hoạt tính khi hấp vơ trùng mơi trường ở nhiệt độ cao. Vì vậy, để khơng giảm hoạt tính khi chuẩn bị mơi trường thí nghiệm tái sinh, chúng tơi sử dụng NAA (0,05 mg/l) kết hợp cùng BAP thay đổi ở các nồng độ khác nhau để đánh giá hiệu quả tái sinh chồi. Để đạt hiệu quả tối đa ở giai đoạn này, chúng tôi tiến hành cắt khối mô sẹo thành 2-3 phần, mục đích để tăng diện tích tiếp xúc của mô sẹo với môi trường tái sinh, làm cho chất điều hòa sinh trưởng có thể được hấp thụ tốt hơn vào các cấu trúc của mô sẹo. Các khối mô sẹo được nuôi trong điều kiện ánh sáng đầy đủ với các môi trường sau:
T0: MS + 0,05mg/l NAA + 30g/l đường + 50ml/l nước dừa + 7g/l agar
Các mơi trường thí nghiệm khả năng tái sinh chồi T1, T2, T3, T4, T5 có cơng thức dựa trên công thức của môi trường đối chứng T0 và bổ sug thêm BAP ở các nồng độ tương ứng là 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0 mg/l để đánh giá mức độ ảnh hưởng của
BAP đối với q trình tái sinh, qua đó có thể lựa chọn nồng độ thích hợp cho giai đoạn này.
Sau 6 tuần nuôi cấy khối mô sẹo trên các môi trường tái sinh, chúng tôi nhận thấy rằng mơi trường có sự kết hợp giữa auxin và cytokinin có khả năng kích hình thành chồi. Khả năng bật chồi từ mô sẹo nuôi cấy chỉ xảy ra trên các mơi trường T3, T4, T5 có các nồng độ BAP tương ứng là 3, 4 và 5 mg/l, trong đó mơi trường T4 có tỷ lệ cao nhất, nhanh hình thành chồi nhất, chỉ với 3 tuần ni cấy, chất lượng chồi tốt nhất, chồi xanh, thể hiện sức sống tốt (hình 3.3). Ở mơi trường T3, chồi có đặc điểm tốt giống ở môi trường T4, nhưng thời gian hình thành chồi chậm hơn nhiều với 5 tuần ni cấy. Với mơi trường T5, chồi có kích thước bé, do có sự ảnh hưởng bởi nồng độ BAP cao. Cho nên, chúng tôi lựa chọn môi trường T4 làm môi trường tái sinh chồi gián tiếp. Tuy nhiên, tỷ lệ tái sinh chồi trên các mơi trường này cịn khá thấp, vì thế bước tiếp theo chúng tơi sử dụng phương pháp nhân nhanh chồi để tăng số lượng chồi một cách nhanh chóng.
Hình 3.3 Tái sinh chồi dưa hấu từ mơ sẹo ở môi trường T4
3.4. Ảnh hƣởng của phytohormone đến nhân chồi từ mô sẹo
Do tái sinh chồi dưa hấu từ mô sẹo cần tới 6 tuần nuôi cấy trên môi trường tái sinh, đồng thời tỷ lệ chồi thu được từ các khối mơ sẹo thấp, do đó để thu được số lượng chồi lớn hơn cho các thí nghiệm khác cần phải tiến hành nhân chồi có nguồn gốc từ mơ sẹo. Các chất thuộc nhóm cytokinin có hoạt tính phân bào mạnh mẽ, do vậy sẽ kích thích q trình hình thành chồi mới, làm gia tăng hệ số nhân chồi trong nuôi cấy in vitro. Trong các thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng riêng rẽ hai
phytohormone phổ biến là BAP và kinetin ở các nồng độ khác nhau để kiểm tra ảnh hưởng đến quá trình phát sinh chồi dưa hấu. Theo tác giả Khatun và đồng nghiệp, mơi trường khi có sự kết hợp giữa BAP hay KIN ở các nồng độ khác nhau với NAA hoặc IBA cho hệ số nhân chồi cao hơn so với môi trường chỉ bổ sung BAP, KIN [22].
Trước tiên, chúng tôi tiến hành thử nghiệm ảnh hưởng của BAP đến sự nhân nhanh chồi dưa hấu có nguồn gốc từ mơ sẹo. Trong các thí nghiệm này, mơi trường đối chứng có thành phần như sau:
B0: MS + 0,1mg/l NAA + 30g/l đường + 50ml/l nước dừa + 7g/l agar
Các mơi trường thí nghiệm B1, B2, B3 và B4 được chuẩn bị như môi trường đối chứng B0 nhưng được bổ sung thêm BAP ở các nồng độ: 0,5; 1,0; 1,5 và 2,0mg/l. Các chồi dưa hấu hình thành từ mô sẹo được dùng để cấy vào môi trường nhân chồi có BAP và tính tốn hệ số nhân chồi sau 4 tuần ni cấy. Kết quả quan sát đã cho thấy, số lượng chồi thu được tăng lên gấp nhiều lần so với lượng chồi ban đầu đưa vào môi trường. Ở môi trường đối chứng khơng có BAP, hệ số nhân chồi sau 4 tuần là khá thấp đạt được khoảng 1,66. Trên môi trường B1 (0,5 mg/l BAP), hệ số nhân chồi đã tăng đáng kể, lên tới 4,33 khi so sánh với 1,66 của mơi trường đối chứng. Ở mơi trường B2 có nồng độ 1,0mg/l BAP từ số lượng chồi ban đầu là 30 đã hình thành tổng số 196 chồi sau khi được nuôi cấy 4 tuần và đạt hệ số nhân chồi là 6,53 lần (bảng 3.4). Ở giai đoạn nhân chồi, hệ số nhân chồi cao sẽ đáp ứng được yêu cầu thí nghiệm đặt ra về số lượng chồi. Với mơi trường B4 có nồng độ BAP là 2,0 cũng đạt hệ số nhân chồi cao là 5,16 lần, tuy nhiên nhiều chồi có kích
thước nhỏ và khó quan sát rõ hình thái của chồi, do đó mơi trường B2 có nồng độ BAP là 1,0mg/l được lựa chọn làm môi trường nhân nhanh chồi có nguồn gốc từ mơ sẹo, tạo ra các chồi có hình thái rõ ràng với kích thước tương đối đồng đều nhau (hình 3.4).
Bảng 3.4 Ảnh hưởng của BAP đến hệ số nhân chồi
MT Nồng độ BAP (mg/l)
Số chồi ban đầu
Sau 4 tuần nuôi cấy
Số chồi thu đƣợc Hệ số nhân (lần)
B0 0,0 30 50 1,66 B1 0,5 30 130 4,33 B2 1,0 30 196 6,53 B3 1,5 30 146 4,86 B4 2,0 30 155 5,16
Để đánh giá ảnh hưởng của Kinetin (KIN) đến khả năng hình thành chồi có nguồn gốc từ mơ sẹo, chúng tơi dùng mơi trường đối chứng B0 có thành phần giống như môi trường đối chứng trong nghiên cứu ảnh hưởng của BAP.
B0: MS + 0,1mg/l NAA + 30g/l đường + 50ml/l nước dừa + 7g/l agar
Các mơi trường thí nghiệm K1, K2, K3 và K4 có các thành phần tương tự như mơi trường B0 nhưng được bổ sung thêm KIN ở các nồng độ tương ứng là 0,5; 1,0; 1,5 và 2,0mg/l. Khả năng hình thành các chồi mới trên những mơi trường có KIN cũng được đánh giá sau 4 tuần nuôi cấy (bảng 3.5).
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của KIN đến hệ số nhân chồi
MT Nồng độ KIN (mg/l)
Số chồi ban đầu
Sau 4 tuần nuôi cấy
Số chồi thu đƣợc Hệ số nhân (lần)
B0 0 30 50 1,66
K1 0,5 30 73 2,43
K2 1,0 30 79 2,63
K3 1,5 30 87 2,9
K4 2,0 30 54 1,8
Các số liệu tính tốn đã cho thấy, trên mơi trường K1 có 0,5 mg/l KIN hệ số nhân chồi chỉ đạt được là 2,43 lần, cao hơn không nhiều so với môi trường đối chứng. Khi tăng nồng độ KIN lên 1,0mg/l ở mơi trường K2 thì hệ số nhân đạt được là 2,63. Hệ số nhân chồi cao nhất trong số các mơi trường thí nghiệm là 2,9 đạt được trên mơi trường K3 có 1,5 mg/l KIN (hình 3.5). Có thể thấy rằng hệ số nhân chồi trên các mơi trường có bổ sung KIN đều thấp hơn trên các mơi trường có BAP. Đồng thời ở các mơi trường có bổ sung KIN, khi quan sát q trình tăng sinh chồi, chúng tơi thấy rằng mơ sẹo có hình thành khá ở phần tiếp xúc của cụm chồi với mơi
trường ni cấy, có thể gây ảnh hưởng tới việc hấp thụ các chất có trong mơi trường. Vì lý do này mơi trường có bổ sung BAP là phù hợp cho quá trình nhân chồi có nguồn gốc từ mơ sẹo, trong đó mơi trường B2 có nồng độ BAP là 1,0mg/l là mơi trường thích hợp nhất.