MT Nồng độ NAA (mg/l) Số mẫu 3 tuần 6 tuần Tỷ lệ tạo mô sẹo (%)
Đặc điểm mô sẹo
Tỷ lệ tạo mô sẹo
(%)
Đặc điểm mô sẹo
C0b 0 20 0,0 Không tạo mô sẹo 0,0 Không tạo mô sẹo
C5 0,5 20 65,0 Màu trắng sữa, xốp 87,5 Màu trắng vàng, xốp
C6 1,0 20 87,5 Màu trắng sữa, xốp 100,0 Màu trắng vàng, xốp
C7 1,5 20 85,0 Màu trắng sữa, xốp 100,0 Màu trắng vàng, xốp
C8 2,0 20 63,63 Màu trắng sữa, xốp 100,0 Màu trắng vàng, xốp
3.3. Ảnh hƣởng của phytohormone đến tái sinh chồi từ mô sẹo
Để thu nhận được các chồi cây in vitro từ mơ sẹo thì q trình tái sinh chồi cần thực hiện trên mơi trường khơng có auxin. Tuy nhiên, theo tác giả Li và cộng sự (2011), các môi trường tái sinh dưa hấu từ lá mầm có sự phối hợp giữa BAP và 1 loại hormone thuộc nhóm auxin cho kết quả tạo chồi tốt hơn khi dùng BAP riêng rẽ [19]. Do IAA là auxin kém bền nhiệt, sẽ bị giảm hoạt tính khi hấp vơ trùng môi trường ở nhiệt độ cao. Vì vậy, để khơng giảm hoạt tính khi chuẩn bị mơi trường thí nghiệm tái sinh, chúng tơi sử dụng NAA (0,05 mg/l) kết hợp cùng BAP thay đổi ở các nồng độ khác nhau để đánh giá hiệu quả tái sinh chồi. Để đạt hiệu quả tối đa ở giai đoạn này, chúng tôi tiến hành cắt khối mơ sẹo thành 2-3 phần, mục đích để tăng diện tích tiếp xúc của mơ sẹo với môi trường tái sinh, làm cho chất điều hịa sinh trưởng có thể được hấp thụ tốt hơn vào các cấu trúc của mô sẹo. Các khối mô sẹo được nuôi trong điều kiện ánh sáng đầy đủ với các môi trường sau:
T0: MS + 0,05mg/l NAA + 30g/l đường + 50ml/l nước dừa + 7g/l agar
Các mơi trường thí nghiệm khả năng tái sinh chồi T1, T2, T3, T4, T5 có cơng thức dựa trên công thức của môi trường đối chứng T0 và bổ sug thêm BAP ở các nồng độ tương ứng là 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0 mg/l để đánh giá mức độ ảnh hưởng của
BAP đối với q trình tái sinh, qua đó có thể lựa chọn nồng độ thích hợp cho giai đoạn này.
Sau 6 tuần nuôi cấy khối mô sẹo trên các môi trường tái sinh, chúng tôi nhận thấy rằng mơi trường có sự kết hợp giữa auxin và cytokinin có khả năng kích hình thành chồi. Khả năng bật chồi từ mô sẹo nuôi cấy chỉ xảy ra trên các mơi trường T3, T4, T5 có các nồng độ BAP tương ứng là 3, 4 và 5 mg/l, trong đó mơi trường T4 có tỷ lệ cao nhất, nhanh hình thành chồi nhất, chỉ với 3 tuần ni cấy, chất lượng chồi tốt nhất, chồi xanh, thể hiện sức sống tốt (hình 3.3). Ở mơi trường T3, chồi có đặc điểm tốt giống ở mơi trường T4, nhưng thời gian hình thành chồi chậm hơn nhiều với 5 tuần ni cấy. Với mơi trường T5, chồi có kích thước bé, do có sự ảnh hưởng bởi nồng độ BAP cao. Cho nên, chúng tôi lựa chọn môi trường T4 làm môi trường tái sinh chồi gián tiếp. Tuy nhiên, tỷ lệ tái sinh chồi trên các mơi trường này cịn khá thấp, vì thế bước tiếp theo chúng tơi sử dụng phương pháp nhân nhanh chồi để tăng số lượng chồi một cách nhanh chóng.
Hình 3.3 Tái sinh chồi dưa hấu từ mô sẹo ở môi trường T4
3.4. Ảnh hƣởng của phytohormone đến nhân chồi từ mô sẹo
Do tái sinh chồi dưa hấu từ mô sẹo cần tới 6 tuần nuôi cấy trên môi trường tái sinh, đồng thời tỷ lệ chồi thu được từ các khối mơ sẹo thấp, do đó để thu được số lượng chồi lớn hơn cho các thí nghiệm khác cần phải tiến hành nhân chồi có nguồn gốc từ mơ sẹo. Các chất thuộc nhóm cytokinin có hoạt tính phân bào mạnh mẽ, do vậy sẽ kích thích q trình hình thành chồi mới, làm gia tăng hệ số nhân chồi trong nuôi cấy in vitro. Trong các thí nghiệm này, chúng tơi sử dụng riêng rẽ hai
phytohormone phổ biến là BAP và kinetin ở các nồng độ khác nhau để kiểm tra ảnh hưởng đến quá trình phát sinh chồi dưa hấu. Theo tác giả Khatun và đồng nghiệp, mơi trường khi có sự kết hợp giữa BAP hay KIN ở các nồng độ khác nhau với NAA hoặc IBA cho hệ số nhân chồi cao hơn so với môi trường chỉ bổ sung BAP, KIN [22].
Trước tiên, chúng tôi tiến hành thử nghiệm ảnh hưởng của BAP đến sự nhân nhanh chồi dưa hấu có nguồn gốc từ mơ sẹo. Trong các thí nghiệm này, mơi trường đối chứng có thành phần như sau:
B0: MS + 0,1mg/l NAA + 30g/l đường + 50ml/l nước dừa + 7g/l agar
Các mơi trường thí nghiệm B1, B2, B3 và B4 được chuẩn bị như môi trường đối chứng B0 nhưng được bổ sung thêm BAP ở các nồng độ: 0,5; 1,0; 1,5 và 2,0mg/l. Các chồi dưa hấu hình thành từ mơ sẹo được dùng để cấy vào mơi trường nhân chồi có BAP và tính tốn hệ số nhân chồi sau 4 tuần ni cấy. Kết quả quan sát đã cho thấy, số lượng chồi thu được tăng lên gấp nhiều lần so với lượng chồi ban đầu đưa vào môi trường. Ở môi trường đối chứng khơng có BAP, hệ số nhân chồi sau 4 tuần là khá thấp đạt được khoảng 1,66. Trên môi trường B1 (0,5 mg/l BAP), hệ số nhân chồi đã tăng đáng kể, lên tới 4,33 khi so sánh với 1,66 của môi trường đối chứng. Ở mơi trường B2 có nồng độ 1,0mg/l BAP từ số lượng chồi ban đầu là 30 đã hình thành tổng số 196 chồi sau khi được nuôi cấy 4 tuần và đạt hệ số nhân chồi là 6,53 lần (bảng 3.4). Ở giai đoạn nhân chồi, hệ số nhân chồi cao sẽ đáp ứng được yêu cầu thí nghiệm đặt ra về số lượng chồi. Với mơi trường B4 có nồng độ BAP là 2,0 cũng đạt hệ số nhân chồi cao là 5,16 lần, tuy nhiên nhiều chồi có kích
thước nhỏ và khó quan sát rõ hình thái của chồi, do đó mơi trường B2 có nồng độ BAP là 1,0mg/l được lựa chọn làm môi trường nhân nhanh chồi có nguồn gốc từ mơ sẹo, tạo ra các chồi có hình thái rõ ràng với kích thước tương đối đồng đều nhau (hình 3.4).