Bảng 3.4 Ảnh hưởng của BAP đến hệ số nhân chồi
MT Nồng độ BAP (mg/l)
Số chồi ban đầu
Sau 4 tuần nuôi cấy
Số chồi thu đƣợc Hệ số nhân (lần)
B0 0,0 30 50 1,66 B1 0,5 30 130 4,33 B2 1,0 30 196 6,53 B3 1,5 30 146 4,86 B4 2,0 30 155 5,16
Để đánh giá ảnh hưởng của Kinetin (KIN) đến khả năng hình thành chồi có nguồn gốc từ mô sẹo, chúng tơi dùng mơi trường đối chứng B0 có thành phần giống như mơi trường đối chứng trong nghiên cứu ảnh hưởng của BAP.
B0: MS + 0,1mg/l NAA + 30g/l đường + 50ml/l nước dừa + 7g/l agar
Các mơi trường thí nghiệm K1, K2, K3 và K4 có các thành phần tương tự như môi trường B0 nhưng được bổ sung thêm KIN ở các nồng độ tương ứng là 0,5; 1,0; 1,5 và 2,0mg/l. Khả năng hình thành các chồi mới trên những mơi trường có KIN cũng được đánh giá sau 4 tuần nuôi cấy (bảng 3.5).
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của KIN đến hệ số nhân chồi
MT Nồng độ KIN (mg/l)
Số chồi ban đầu
Sau 4 tuần nuôi cấy
Số chồi thu đƣợc Hệ số nhân (lần)
B0 0 30 50 1,66
K1 0,5 30 73 2,43
K2 1,0 30 79 2,63
K3 1,5 30 87 2,9
K4 2,0 30 54 1,8
Các số liệu tính tốn đã cho thấy, trên mơi trường K1 có 0,5 mg/l KIN hệ số nhân chồi chỉ đạt được là 2,43 lần, cao hơn không nhiều so với môi trường đối chứng. Khi tăng nồng độ KIN lên 1,0mg/l ở môi trường K2 thì hệ số nhân đạt được là 2,63. Hệ số nhân chồi cao nhất trong số các mơi trường thí nghiệm là 2,9 đạt được trên mơi trường K3 có 1,5 mg/l KIN (hình 3.5). Có thể thấy rằng hệ số nhân chồi trên các mơi trường có bổ sung KIN đều thấp hơn trên các mơi trường có BAP. Đồng thời ở các mơi trường có bổ sung KIN, khi quan sát quá trình tăng sinh chồi, chúng tơi thấy rằng mơ sẹo có hình thành khá ở phần tiếp xúc của cụm chồi với môi
trường ni cấy, có thể gây ảnh hưởng tới việc hấp thụ các chất có trong mơi trường. Vì lý do này mơi trường có bổ sung BAP là phù hợp cho quá trình nhân chồi có nguồn gốc từ mơ sẹo, trong đó mơi trường B2 có nồng độ BAP là 1,0mg/l là mơi trường thích hợp nhất.
Hình 3.5 Kết quả nhân chồi trên môi trường K3 sau 4 tuần 3.5. Kéo dài chồi
Kết thúc giai đoạn nhân nhanh chồi, chúng tơi đã có được số lượng chồi lớn, để có thể tạo thành cây hồn chỉnh, chúng tơi phải tiến hành tạo rễ. Tuy nhiên, nếu chồi nhỏ dẫn tới hình thành cây con có kích thước bé, gây bất lợi cho việc chuyển ra môi trường bên ngồi. Vì thế, bước kéo dài chồi đóng vai trị là bước đệm để tạo chất lượng cây con tốt.
Cấy chồi vào mơi trường MS có bổ sung 30g/l đường, 50ml/l nước dừa, 7g/l agar. Sau 3 tuần, khi chiều dài chồi đạt khoảng 3 - 4 cm, chúng tôi tiến hành chuyển vào môi trường ra rễ.
3.6. Tạo rễ cho chồi dƣa hấu in vitro
Từ các chồi dưa hấu nuôi cấy trên môi trường kéo dài chồi, chúng tôi đã lựa chọn các chồi dài và khỏe mạnh để thử nghiệm cho quá trình hình thành rễ in vitro. Tạo rễ cho các chồi dưa hấu là giai đoạn rất quan trọng giúp cho cây con có thể sinh trưởng được trên mơi trường tự nhiên. Để thử nghiệm quá trình tạo rễ cho các chồi dưa hấu có nguồn gốc từ mơ sẹo, chúng tôi đã sử dụng mơi trường khống MS nhưng có hàm lượng giảm đi một nửa, như sau:
Môi trường đối chứng R0: 1/2MS + 0,1 mg/l BAP + 30g/l đường +7g/l agar. Các mơi trường thí nghiệm R1, R2, R3, R4 có thành phần tương tự như môi trường đối chứng R0 nhưng được bổ sung thêm IBA ở các nồng độ khác nhau: 0,1; 0,25; 0,50 và 1,0 mg/l. Trong nhóm auxin, IBA cùng với NAA là hai phytohormone có hoạt tính mạnh trong kích thích tạo rễ ở nhiều lồi thực vật, vì vậy để thử nghiệm hình thành rễ của các chồi dă hấu, chúng tôi đã sử dụng IBA có dải nồng độ từ 0,1 – 1,0 mg/l.
Bảng 3.6 Kết quả hình thành rễ trên mơi trường có bổ sung IBA
MT Nồng độ IBA (mg/l) Số mẫu cấy Sự hình thành rễ sau 1 tuần 4 tuần Tỷ lệ (%) Số rễ TB/cây Tỷ lệ (%) Số rễ TB/cây R0 0,00 30 10,5 1,00 31,5 1,50 R1 0,10 30 46,7 2,75 75,0 3,50 R2 0,25 30 42,5 3,90 95,0 4,80 R3 0,50 30 43,3 3,50 86,7 4,20 R4 1,00 30 38,3 3,30 81,7 3,75
Hình 3.6 Sự hình thành rễ trên mơi trường R2 (có 0,25mg/l IBA)
Từ bảng số liệu về hình thành rễ của chồi dưa hấu đã cho thấy tất cả các mơi trường thử nghiệm có bổ sung IBA đều cho tỷ lệ hình thành rễ cao hơn so với mơi trường khơng có IBA, mặc dù môi trường đối chứng R0 cũng có hình thành rễ nhưng tỷ lệ ra rễ thấp (10,5 và 31,5% sau 1 và 4 tuần nuôi cấy). Tỷ lệ ra rễ nhiều hơn chứng tỏ IBA là chất kích thích ra rễ phù hợp đối với chồi dưa hấu nuôi cấy in
vitro. Sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường, khi nồng độ IBA tăng từ 0,1 mg/l lên
0,25 mg/l tỷ lệ hình thành rễ trên các chồi dưa hấu đã tăng từ 75,0% lên 95,0%. Tuy vậy khi tăng cao nồng độ của IBA từ 0,25 mg/l lên 0,5 mg/l thì tỷ lệ ra rễ giảm xuống 86,7 %, tiếp tục tăng nồng độ lên 1,0 mg/l tỷ lệ ra rễ giảm xuống 81,7% sau 4 tuần nuôi cấy. Đồng thời cũng giống như tỷ lệ ra rễ, số lượng rễ đạt được cao nhất là 4,8 rễ/cây ở môi trường R2 có nồng độ 0,25 mg/l IBA (hình 3.6 ). Như vậy, chúng tơi đánh giá có thể nồng độ IBA q cao sẽ gây kìm hãm sự ra rễ và dẫn đến làm giảm số lượng rễ. Đối với môi trường đối chứng không có phytohormone nhưng vẫn ra rễ là do dinh dưỡng môi trường nuôi cấy đã bị giảm đi một nửa đã cảm ứng kích thích các tế bào hình thành rễ, giúp cây có thể hấp thu đủ lượng chất dinh dưỡng cần thiết. Tuy nhiên tỷ lệ ra rễ thấp và số lượng rễ không nhiều và không đồng đều so với mơi trường có bổ sung IBA.
3.7. Thử nghiệm đƣa cây dƣa hấu ra giá thể
Sau thời gian ni trên mơi trường kích thích ra rễ, những chồi dưa hấu khỏe mạnh và có hệ rễ tốt sẽ được lựa chọn cho thí nghiệm trồng cây trên giá thể đất thị và đất mùn theo tỷ lệ pha trộn về thể tích là 1:1. Trước tiên loại bỏ agar và những chất dinh dưỡng còn bám trên rễ bàng cách rửa nhẹ nhàng nhiều lần trong nước, sau đó trồng trên giá thể nhân tạo. Sau khoảng một tuần trên giá thể, các cây dưa hấu con đã thể hiện sự tăng trưởng rõ rệt, qua sự tăng chiều cao của chồi và bắt đầu hình thành thêm các lá mới. Điều này chứng tỏ hệ rễ của cây dưa hấu con đã có thể thu nhận đủ nước, cùng với các khống chất có trong giá thể nhân tạo cung cấp cho quá trình sinh trưởng của cây.
Do điều kiện hạn chế về thời gian nên chúng tôi mới chỉ thử nghiệm trồng trên 1 loại giá thể được chứng minh là phù hợp với giai đoạn thích ứng ban đầu của cây dưa hấu có nguồn gốc in vitro. Những cây dưa hấu con đã thể hiện sự thích nghi với mơi trường sống mới bên ngồi. Như vậy, việc đưa các cây dưa hấu từ bình ni cấy in vitro ra trồng trên giá thể đã đạt được những kết quả bước đầu.
KẾT LUẬN
1. Khử trùng hạt dưa hấu đã bóc vỏ bằng dung dịch NaOCl ở nồng độ 0,5% trong thời gian 5 phút là phù hợp, đạt tỷ lệ mẫu sống là 100%.
2. Mơi trường MS có bổ sung thêm 1,0 mg/l NAA và 0,5 mg/l BAP là mơi trường thích hợp để kích thích hình thành mơ sẹo từ lá mầm hạt dưa hấu cho tỷ lệ tạo mô sẹo là 87,5 và 100% tương ứng sau 3 và 6 tuần nuôi cấy.
3. Môi trường MS được bổ sung 4,0 mg/l BAP là thích hợp cho q trình tái sinh chồi từ mô sẹo dưa hấu.
4. Mơi trường MS có 0,1 mg/l NAA và 1,0 mg/l BAP được sử dung cho giai đoạn nhân nhanh chồi với hệ số nhân cao nhất là 6,55 lần.
5. Các chồi dưa hấu được nuôi trên môi trường MS trong thời gian 3 tuần trước khi được cấy vào mơi trường có thành phần khống 1/2MS và 0,25mg/l IBA đã cho tỷ lệ ra rễ đạt 95% sau 4 tuần nuôi cấy.
KIẾN NGHỊ
Do điều kiện hạn chế về thời gian, chúng tôi chưa thể tiến hành đưa cây dưa hấu ra bầu đất với số lượng lớn, cũng như chưa thử nghiệm trên một số loại giá thể khác. Vì vậy, chúng tôi kiến nghị được tiếp tục nghiên cứu theo dõi quá trình sinh trưởng và phát triển của cây khi đưa ra vườn ươm, đồng thời tiếp tục hướng nghiên cứu trên các loại giống dưa hấu khác với mục đích đáp ứng nguồn giống một cách đa dạng hơn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt:
1. Dương Công Kiên (2003), nuôi cấy mô tế bào thực vật tập 2, Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh.
2. Lê Văn Hồng (2008), Cơng nghệ ni cấy mơ & tế bào thực vật, giáo trình Đại học Đà Nẵng.
3. Lương Ngọc Toản – Phan Nguyên Hồng- Hoàng Thị Sản- Võ Văn Chi (2000), phân loại thực vật học, Tủ sách Đại học Sư phạm.
4. Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật – nghiên cứu và ứng dụng, nhà xuất bản nơng nghiệp Hà Nội.
5. Nguyễn Hồng Lộc – Lê Việt Dũng (2009), Nuôi cấy mô và tế bào thực vật, Viện Tài nguyên Môi trường và Công nghệ Sinh học Đại học Huế.
6. Nguyễn Mạnh Chinh, Nguyễn Đăng Nghĩa (2006), Trồng – chăm sóc và phịng trừ sâu bệnh, Nhà xuất bản Nơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh.
7. Nguyễn Minh Chơn (2008), Các chất điều hồ sinh trưởng thực vật, Giáo trình Đại học Cần Thơ.
8. Nguyễn Nghĩa Thìn, Đặng Thị Sy (1998), Hệ thống học thực vật, Giáo trình Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội.
9. Nguyễn Thị Thanh Nga, Hồ Mạnh Tường, Phạm Thị Vân, Nguyễn Tường Vân, Chu Hồng Hà, Lê Trần Bình (2012), Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào cây dưa hấu (Citrullus lanatus Thumb.). Tạp chí Sinh học, 34(3): 389-396.
10. Vũ Văn Vụ (1999), Sinh lý thực vật và ứng dụng, Nhà xuất bản giáo dục Hà Nội.
11. Vũ Văn Vụ (2000), Sinh lý thực vật, Nhà xuất bản giáo dục Hà Nội.
Tiếng Anh:
12. Candolle (1882) Origin of Cultivated Plants, sv "Water-melon", International scientific series (New York), D. Appleton and Co, p.262.
13. Chaturvedi R., Bhatnagar P. (2001), High-frequency shoot regeneration from cotyledon explants of watermelon cv. sugar baby. In Vitro Cell. Dev. Biol.- Plant, 37: 255-258.
14. Compton M.E. (2000), Interaction between explant size and cultivar affects shoot organogenic competence of watermelon cotyledons. Hort. Science, 35(4): 749-750.
15. Dane, Fenny; Liu, Jiarong (2006), Diversity and origin of cultivated and citron type watermelon (Citrullus lanatus). Genetic Resources and Crop Evolution, Vol.54, Issue 6, p.1255-1265.
16. F.suratman, F.Huyop and G.K.A. Parveez (2009), In vitro Shoot Regeneration of Citrullus vulgaris Schrad (Watermelon), biotechnology 8(4): p.393-404. 17. Keng C.L., Hoong L.K. (2005), In vitro planets regeneration from nodal
segments of Musk melon (Cucumis melo L.). Biotechnol. 4(4): 354-357.
18. Khatun M. M, Hossain M. S, Haque M. A and Khalekuzzaman M (2010), In vitro propagation of Citrullus lanatus Thumb.from nodal explants culture, J.
Bangladesh Agril. Univ. 8(2): p.203–206.
19. Jules Janick, Harry S. Paris, David C. Parrish (2007), The Cucurbits of Mediterranean Antiquity: Identification of Taxa from Ancient Images and Descriptions, 100(7): p.1441–1457.
20. Li J., Li X. M., Qin Y. G., Tang Y., Wang L., Ma C. and Li H. X. (2011), Optimized system for plant regeneration of watermelon (Citrullus lanatus Thumb.). African Journal of Biotechnology Vol. 10(48), pp. 9760-9765.
21. Sultana R.S., Bari M.A. (2003), Effect of different plant growth regulators on direct regeneration of watermelon (Citrullus lanatus thumb.). Plant Tissue Cult., 13(2): 173-177.
PHỤ LỤC Môi trƣờng MS STT Tên hóa chất Nồng độ (mg/l) 1 NH4NO3 1650 2 CaCl2 332,2 3 MgSO4.7H2O 370 4 KNO3 1900 5 KH2PO4 140 6 H3BO3 6,2 7 CoCl2 0,025 8 CuSO4.5H2O 0,025 9 Na2EDTA 37,3 10 FeSO4.7H2O 27,8 11 MnSO4.7H2O 16,9 12 KI 0,83 13 Na2MO4.7H2O 0,25 14 ZnSO4.7H2O 8,6