CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.5. Phương pháp sắc ký ái lực
Phương pháp sắc ký là phương pháp phổ biến nhất để tinh sạch protein. Các protein thường dễ mất hoạt tính sinh học khi bị tách ra khỏi tế bào hay cơ thể. Mỗi protein khác nhau lại nhạy cảm với những tác nhân ở các mức độ khác nhau. Vì vậy cần lựa chọn phương pháp tinh sạch protein đơn giản mà hiệu quả nhất đồng thời khơng làm mất hoạt tính của protein cần tinh sạch. Nguyên tắc chung của hệ thống sắc ký bao gồm 2 pha: Pha cố định (A) và pha chuyển động (B). Các chất cần tách ra khỏi nhau phải có tỷ số hệ số phân bố trong pha A và B khác nhau. Lựa chọn A và B dựa vào sự khác nhau của các chất cần tách. Các bước chính trong q trình sắc ký bao gồm: Nhồi cột, cân bằng cột, nạp mẫu, rửa cột, rửa chiết, phân đoạn. Sau đó phân tích và đánh giá kết quả hàm lượng, hoạt tính, độ sạch của chế phẩm. Trong đó sắc ký ái lực phân tách protein dựa trên nguyên tắc tương tác đặc hiệu sinh học, thuận nghịch giữa protein với phối tử đặc hiệu gắn trên gel. Cho phép tinh sạch hợp chất cần quan tâm một cách khá đặc hiệu, có thể chỉ cần một bước đã thu được chế phẩm tinh sạch. Quá trình tinh sạch cịn cho phép cơ đặc mẫu, rất cần thiết đối với những chất có nồng độ thấp.
Thí nghiệm của chúng tơi sử dụng phương pháp sắc ký ái lực với protein tái tổ hợp được tinh sạch bằng cột resin gắn Niken đặc hiệu cho các protein tái tổ hợp có đi polyhistidine. Trong đó, resin là chất mang dạng liên kết chéo, chứa thụ thể iminodiacetic acid và chất này làm cầu nối với Ni2+. Cột Resin-Niken có ái lực cao với đi polyhistidine. Việc gắn kết hình thành thơng qua liên kết giữa ion Ni2+ và đuôi 6X-His trong phân tử protein. Tinh sạch protein được thực hiện dưới điều kiện khơng biến tính như chỉ dẫn của Invitrogen. Protein liên kết với resin được rửa giải bằng đệm pH thấp hoặc bằng đệm chứa muối imidazol. Quy trình tinh sạch được tiến hành như sau: 3ml mẫu cô từ dịch nuôi biểu hiện p53 ở nấm men được pha loãng 3 lần với đệm gắn cột N1 để đưa lên cột chứa 2 ml Niken-Sapharose đã được cân bằng với đệm gắn cột N1. Sau đó, cột được rửa 3 lần, mỗi lần với 8 ml đệm rửa N2 cho tới khi OD280 nm < 0,05 (mức tin tưởng khơng cịn protein trôi ra trong
phẩm protein tinh sạch được điện di kiểm tra trên gel polyacrylamide 15%. Bảo quản protein bằng dung dịch P (glycerol 20%, BSA 1%) ở nhiệt độ -20oC.