Dựa vào phương trình đường chuẩn (Hình 3.14), chúng tơi xác định được nồng độ trong mẫu cần định lượng (X) bằng công thức sau:
X (mg/ml) = (𝑦−0,1764) 0,0198.𝑉
Trong đó, y là giá trị OD595 nm đã đo được ở mẫu, V (µl) là thể tích mẫu đã sử dụng trong phản ứng Bradford.
Với 6 ml dịch cô được đưa lên cột, chúng tôi thu lại được 3 ml dịch tinh sạch chứa protein p53 tái tổ hợp và sử dụng để làm mẫu đo trong phản ứng định lượng Bradford. Kết quả đo OD595 nm và nồng độ protein tương ứng được trình bày trong Bảng 8 y = 0.0198x + 0.1764 R² = 0.9392 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 0 10 20 30 40 50 60 OD 595 nm mBSA OD595 nm Linear (OD595 nm)
Bảng 8: Kết quả đo nồng độ protein bằng phương pháp Bradford của q trình tinh sạch
Dịch cơ Dịch trôi cột FT TAT-p53-His Hiệu suất (%)
V (µl) 50 50 50 -
OD595 nm 0.825 0.188 1.185 -
Nồng độ (mg/ml) 0.655 0.011 1.019 77.8
Lượng protein tổng số trong 6ml dịch cô là:
mprotein tổng số = 0.655 x 6 = 3.93 (mg)
Lượng protein p53 tái tổ hợp thu được trong 3ml dịch tinh sạch là: mp53 = 1.019 x 3 = 3.057 (mg)
Hiệu suất tinh sạch là:
H = mp53: mprotein tổng số = 3.057/3.93 = 77.8% Với 60ml dịch cô, lượng protein tổng số là:
mprotein tổng số = 60 x 0,655 = 39.3 (mg)
Với hiệu suất H= 0,778, tổng lượng p53 tái tổ hợp thu được từ 60ml dịch cô là: mp53 = 39.3 x 0.778 = 30.5754 (mg)
Do vậy, với 400ml môi trường nuôi biểu hiện (tương đương với 60ml dịch cơ) thì nồng độ p53 tái tổ hợp thu hồi được là 30.5754 mg. Từ kết quả này so sánh với kết quả của các nghiên cứu trước cũng như nghiên cứu của Thạc sĩ Trần Thị Thúy Nga năm 2017, chúng tôi đưa ra kết luận rằng đã tinh sạch được protein p53 tái tổ hợp với nồng độ cao hơn, khả năng tinh sạch cũng như hiệu quả tinh sạch cao hơn. Tại điều kiện tinh sạch pH=8.0 cho thấy hiệu quả tinh sạch trở nên rõ ràng hơn so với điều kiện tinh sạch tại pH=6.0 như trước đó. Đồng thời tuy lượng dung dịch thu lại sau mỗi lần tinh sạch ít hơn so với lượng dịch cho vào một nửa nhưng hiệu suất tinh sạch lại thể hiện rõ ràng hơn 21,8% so với kết quả công bố trước đây.
3.2. Kết quả nuôi tế bào ung thư in vitro
Dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa và ung thư máu KMS-20 là hai dòng tế bào được sử dụng cho nghiên cứu, dịng HeLa có đặc điểm sinh trưởng và phát triển bám dính, cịn dịng KMS-20 có đặc điểm là sống trơi nổi trong mơi trường nuôi cấy.
Điều kiện tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển là ở điều kiện 37oC, 95% O2 và 5% CO2, môi trường nuôi cấy DMEM low với dòng HeLa và RPMI 1640 với dòng tế bào KMS-20 có bổ sung 10% FBS và 1% kháng sinh (Ampicillin / streptomycin).
A B
Hình 16: Tế bào HeLa (A) và tế bào KMS-20 (B) sau 48h nuôi cấy in vitro (VK10, room 5.6)
3.2.1. Kết quả kiểm tra khả năng ảnh hưởng của môi trường pha thuốc tới tế bào ung thư nuôi cấy tới tế bào ung thư nuôi cấy
Môi trường để bảo quản protein p53-his sử dụng là Glycerol (25%) + BSA (~1%) + Sucrose (~0.01%). Chúng tôi sử dụng nguyên nồng độ dung dịch như trên nhưng thay vì được pha với protein p53-his thì chúng tơi pha với mơi trường ni cấy của 2 dòng tế bào HeLa (DMEM low) và KMS-20 (RPMI 1640) trong 10% FBS và 1% kháng sinh P-S. Sau đó ni cả 2 dòng tế bào ở 37oC, 5%CO2 trong 24h. Kết quả nuôi cấy như sau:
Hình 17: Tế bào HeLa trong điều kiện có mơi trường pha mẫu P và khơng có mơi trường pha mẫu P soi dưới kính hiển vi (VK10, room 5.6)
Chú thích: A: Tế bào HeLa khơng có mơi trường pha mẫu P; B: Tế bào HeLa trong điều kiện có mơi trường pha mẫu P.
Với kết quả tế bào HeLa thu được chúng tôi nhận thấy tế bào HeLa được nuôi trong mơi trường có sử dụng mơi trường pha mẫu khơng thể hiện sự khác biệt so với dịng tế bào đối chứng được ni trong mơi trường ni cấy bình thường. Từ đó có thể kết luận rằng mơi trường sử dụng để pha mẫu khơng có ảnh hưởng đến sức sống, khả năng sinh trưởng của dòng tế bảo HeLa.
Với dịng tế bào KMS-20:
Hình 18: Tế bào KMS-20 trong điều kiện có mơi trường pha mẫu P và khơng có mơi trường pha mẫu P soi dưới kính hiển vi (VK10, room 5.6)
Chú thích: A: Tế bào KMS-20 khơng có mơi trường pha mẫu P; B: Tế bào KMS-20 trong điều kiện có mơi trường pha mẫu P.
A B
B A
Với kết quả tế bào KMS-20 thu được chúng tôi nhận thấy tế bào KMS-20 được ni trong mơi trường có sử dụng mơi trường pha mẫu khơng thể hiện sự khác biệt so với dòng tế bào đối chứng được nuôi trong môi trường ni cấy bình thường. Từ đó có thể kết luận rằng mơi trường sử dụng để pha mẫu khơng có ảnh hưởng đến sức sống, khả năng sinh trưởng của dịng tế bảo KMS-20.
3.2.2. Kết quả thử độc tính tế bào và khả năng ức chế tăng trưởng tế bào ung thư với thuốc thử là protein p53 tái tổ hợp ung thư với thuốc thử là protein p53 tái tổ hợp
Sau khi tra thuốc ở 48h với dải 7 nồng độ: 7 µg/ml – 3.5 µg/ml – 1.75 µg/ml – 0.875 µg/ml – 0.4375 µg/ml – 0.21875 µg/ml – 0.109375 µg/ml trên đĩa 96 giếng tại điều kiện 37oC, 5% CO2. Chúng tôi quan sát dưới kính hiển vi và ghi lại hình ảnh hình thái tế bào tất cả các giếng ở đối chứng cũng như thí nghiệm, từ đó so sánh sự thay đổi về số lượng, hình thái giữa các lơ.
Hình 19: Hình thái tế bào HeLa sau 48h ủ với chế phẩm p53 với các nồng độ thử nghiệm khác nhau (VK10, room 5.6)
Chú thích: A: giếng đối chứng; B: giếng sử dụng nồng độ thuốc 0.109375 µg/ml; C: giếng sử dụng nồng độ thuốc 0.875 µg/ml; D: giếng sử dụng nồng độ thuốc 7 µg/ml.
Kết quả thu được cho thấy, đối với dòng tế bào HeLa, dòng tế bào có đặc điểm sống bám dính. dưới tác dụng của chế phẩm P53-his ở tất cả các nồng độ thử nghiệm đều cho thấy khơng có sự khác biệt nào so với đối chứng cả về mật độ cũng như hình thái tế bào.
Hình 20: Hình thái tế bào KMS-20 sau 48h ủ với chế phẩm p53-his với các nồng độ thử nghiệm khác nhau (VK10, room 5.6)
Chú thích: A: giếng đối chứng; B: giếng sử dụng nồng độ thuốc 0.109375 µg/ml; C: giếng sử dụng nồng độ thuốc 0.875 µg/ml; D: giếng sử dụng nồng độ thuốc 7 µg/ml.
Kết quả đối với dịng tế bào KMS-20, dịng tế bào có đặc điểm sống trơi nổi trong dịch nuôi cấy, dưới tác dụng của chế phẩm P53-his cho thấy sự khác biệt rõ ràng. Trong đó, với nồng độ thuốc thử cao nhất 7 µg/ml cho thấy tế bào vẫn sống sót, tế bào vẫn trịn đều, sáng chứng tỏ thuốc khơng ảnh hưởng làm gây chết tế bào. Tuy nhiên số lượng tế bào rất ít, chỉ chiếm khoảng 20% bề mặt giếng, ít hơn rất nhiều so với giếng đối chứng sinh trưởng khoảng 90% bề mặt giếng. Trong khi đó
lượng tế bào gần như không khác biệt quá lớn so với giếng đối chứng. Từ đây chúng tơi dự đốn rằng chỉ số IC50 của chế phẩm protein tái tổ hợp p53-his nằm trong khoảng giới hạn của các nồng độ thử nghiệm.
Với kết quả về so sánh hình thái thu được cho thấy chế phẩm P53-his không thể hiện tính độc trên hai dịng tế bào nghiên cứu HeLa và KMS-20, có tác dụng ức chế q trình sinh trưởng và phát triển của dòng tế bào ung thư máu KMS-20.
Kết quả nhuộm đĩa 96 giếng với thuốc thử MTS cho thể hiện màu rõ ràng từ màu vàng nhạt đến màu nâu đậm đối với dòng KMS-20 với các nồng độ thuốc thử khác nhau như sau:
Hình 21: Dải màu sau khi thêm MTS vào dịng tế bào KMS-20 sau khi thử hoạt tính của protein p53 tái tổ hợp
Chú thích: ĐC: Đối chứng; 1,2,3,4,5,6,7: Dải thử nồng độ từ 0,109375 µg/ml đến 7 µg/ml với bước nhảy 0,5 lần mỗi giếng.
Kết quả đo OD490 nm bằng máy đo quang học với bước sóng cực đại 490nm: Với dịng tế bào KMS-20:
Bảng 9: Kết quả đo OD490 nm với dòng tế bào KMS-20 thử nghiệm thuốc Nhiệt độ (oC) Đối chứng C7 C6 C5 C4 C3 C2 C1 25.8 0.7875 0.7189 0.7012 0.65 0.6063 0.4754 0.372 0.3964 25.8 0.6909 0.7587 0.6473 0.6461 0.56 0.4576 0.3679 0.3987 25.8 0.721 0.8672 0.8646 0.7512 0.6123 0.4667 0.4411 0.4688 Ghi chú: C1: 7 µg/ml; C2: 3.5 µg/ml; C3: 1.75 µg/ml; C4: 0.875 µg/ml; C5: 0.4375 µg/ml; C6: 0.21875 µg/ml; C7: 0.109375 µg/ml.
Với kết quả đo được bảng 9 trên, hoàn toàn phù hợp với kết quả so sánh hình thái. Để xác định cụ thể giá trị IC50 của từng chất, dựa vào mối tương quan giữa nồng độ chất thử và số lượng tế bào, bằng phương pháp toán học trong Excell chúng tôi vẽ biểu đồ và thu được giá trị IC50=2.1 µg/ml đối với dịng KMS-20, đối với dịng HeLa thì chưa xác định được giá trị này vì ngay tại nồng độ thử nghiệm cao nhất về số lượng và hình thái đạt mức tương đương với đối chứng.
Hình 22: Biểu đồ mối tương quan giữa logarit nồng độ chất thử và chỉ số tăng sinh A%
Với giá trị IC50=2.1µg/ml, cho thấy rằng chế phẩm đã thể hiện rõ ràng tính ức chế 50% sinh trưởng tế bào KMS-20, chưa thấy tác dụng gây độc cho tế bào.
y = 27.723x3- 158x2+ 250.32x - 15.118 R² = 0.9925 0 20 40 60 80 100 120 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 A%
KẾT LUẬN
Từ kết quả thu được, chúng tôi đưa ra một số kết luận như sau:
1. Đã tối ưu được quy trình tinh sạch protein p53-his được biểu hiện trên chủng nấm men Pichia pastoris X33-36 ở pH = 8.0, đạt hiệu suất tinh sạch lên đến 77,8%.
2. Đã thử nghiệm độc tính và khả năng ức chế của chế phẩm protein p53-his ở mức độ tế bào trên 2 dòng tế bào ung thư máu KMS-20 và dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa cho kết quả chế phẩm chỉ gây ức chế sự sinh trưởng ở dòng tế bào KMS-20 mà không gây độc cho tế bào.
KIẾN NGHỊ
Từ kết quả thu được, chúng tôi đưa ra một số kiến nghị như sau:
1. Tiếp tục sử dụng chế phẩm p53 tái tổ hợp ở các dòng tế bào ung thư khác và thử nghiệm ở cấp độ mô, cơ thể nhằm kiểm nghiệm khả năng đưa chế phẩm để chữa trị cho các bệnh nhân ung thư.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Andreas C., Joerger and Alan R. Fersht, (2010), “The Tumor Suppressor p53: From Structures to Drug Discovery”, Cold Spring Harb Perspect Biol, pp. 5-6.
2. Arnold J. Levine, (2017), “The Evolution of Tumor Formation in Humans and Mice with Inherited Mutations in the p53 Gene”, Curr Top Microbiol Immunol. 2017, pp. 1.
3. Brandon JA., LK. Gemma, J. Ana, JH. Marco, and A. Strasser. (2018), “How does p53 induce apoptosis and how does this relate to p53- mediated tumour suppression?”, Cell Death and Differentiation.
4. Choudhary S. , Mathew M. and Verma RS., (2011), “Therapeutic potential of anticancer immunotoxins”, Drug Discov Today. 2011 Jun, pp. 495- 503.
5. Creagan, T. Edward and Mayo C. (2001), “Mayo Clinic on healthy
aging”.
6. Dillman RO., (2011), “Cancer immunotherapy”, Cancer Biother Radiopharm, pp. 1-64.
7. el-Deiry W. S. , S.E. Kern, J.A. Pietenpol, K. W. Kinzler and Vogelstein B., (1992). “Definition of a consensus binding site for p53. Nature Genetics”, pp. 45-49.
8. el-Deiry W. S. , T. Tokino, V. E. Velculescu, D. B. Levy, R. Parsons, J. M. Trent, D. Lin, W. E. Mercer, K. W. Kinzler and Vogelstein B., (Nov 19), “WAF1, a potential mediator of p53 tumor suppression”,
Cell. 1993, pp. 17-25.
9. el-Deiry W. S., T. Tokino, T. Waldman, J. D. Oliner, V. E. Velculescu, M. Burrel, D. E. Hill, E. Healy, J. L. Rees and Hamilton S. R., (1995), “Topological control of p21WAF1/CIP1 expression in normal and neoplastic tissues”, Cancer Res, pp. 9.
10. Freddie B., J. Ferlay; I. Soerjomataram, R. L. Siegel, L. A. Torre and Ahmedin J. (2018), Global Cancer Statistics 2018: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries, CA CANCER J CLIN 2018.
11. Friedman PN., X. Chen, J. Bargonetti and Prives C. (1993), “The p53 protein is an unusually shaped tetramer that binds directly to DNA”, pp. 5878.
12. GBD 2015 Risk Factors Collaborators. Global, regional, and national comparative risk assessment of 79 behavioural, environmental and occupational, and metabolic risks or clusters of risks, 1990-2015: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015,
Lancet. 2016 Oct; 388 (10053): pp. 1659-1724.
13. Hunter J. J., B. L. Bond and Parslow T. G., (1996), “Functional dissection of the human Bcl2 protein: sequence requirements for inhibition of apoptosis”, Mol Cell Biol, pp. 877-83.
14. Kappeler KV., J. Zhang, TN. Dinh, J. Strom and Chen QM. (2012),
“Histone Deacetylase 6 Associates with Ribosomes and Regulates De
Novo Protein Translation during Arsenite Stress”, Toxicol, Sci, pp.
246-55.
15. Kastan M. B., Q. Zhan, W. S. el-Deiry, F. Carrier, T. Jacks, W. V. Walsh, B. S. Plunkett, B. Vogelstein and Fornace AJ. Jr., (1992), “A
mammalian cell cycle checkpoint pathway utilizing p53 and GADD45 is defective in ataxia-telangiectasia”, Cell, 1992 Nov 13; pp. 587-97. 16. Lane, edited by Arnold J. Levine and David P. (2010),The p53 family: a
subject collection from Cold Spring Harbor Perspectives in biology. Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
17. Liu MA., (2011), “Cancer vaccine”, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci.
2011 Oct 12; pp. 2823-6.
18. M. Fischer, (2017), “Census and evaluation of p53 target genes”, Oncogene. 2017 Jul 13, pp. 3943–3956.
19. Maria-Cristina SP. and Thiessa RV., (2013), “Production of recombinant immunotherapeutics for anticancer treatment”, Bioengineered, pp. 306. 20. McBride OW., D. Merry and Givol D. (January 1986), "The gene for human p53 cellular tumor antigen is located on chromosome 17 short arm (17p13)", Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America, pp. 130–4.
21. Mraz M., K. Malinova, J. Kotaskova, S. Pavlova, B. Tichy, J. Malcikova, Stano K. Kozubik, J. Smardova, Y. Brychtova, M. Doubek, M. Trbusek, J. Mayer and Pospisilova S. (June 2009), "miR-34a, miR-29c and miR-17-5p are downregulated in CLL patients with TP53 abnormalities", Leukemia, pp. 1159–63.
22. Özlem SA., (2017), In Vitro Cytotoxicity and Cell Viability Assays: Principles, Advantages, and Disadvantages, pp. 5.
23. Plummer M, C. de Martel, J. Vignat, J. Ferlay, F. Bray and Franceschi S. (2012), “a synthetic analysis. Lancet Glob Health”, Global burden of cancers attributable to infections in 2012: pp. 30143-7.
24. Ricardo A., M. B. Sherman, K. Brownless, R. Lurz, A. L. Okorokov and Elena V. O., (2011),” Quaternary structure of the specific p53–DNA complex reveals the mechanism of p53 mutant dominance”, Nucleic Acids Research, Vol. 39, No. 20, pp. 5.
25. Roth JA., Nguyen D., Lawrence DD., Kemp BL., Carrasco CH., Ferson DZ., Hong WK., Komaki R., Lee JJ., Nesbitt JC., Pisters KM., Putnam JB., Schea R., Shin DM., Walsh GL., Dolormente MM., Han CI., Martin FD., Yen N., Xu K., Stephens LC., McDonnell TJ., Mukhopadhyay T. and Cai D., (1996), “Retrovirus-mediated wild-type p53 gene transfer to tumors of patients with lung cancer”, Nat Med.
1996 Sep, pp. 985-91.
26. Stewart BW., CP. Wild, editors, World cancer report 2014, “Lyon:
International Agency for Research on Cancer”.
27. Surget S., MP. Khoury and Bourdon JC. (December 2013), "Uncovering the role of p53 splice variants in human malignancy: a clinical perspective", OncoTargets and Therapy, pp. 57–68.
28. Wang P., M. Reed, Y. Wang, G. Mayr, JE. Stenger, ME. Anderson, JF. Schwedes and Tegtmeyer P. (1994), “p53 domains: structure, oligomerization, and transformation”, pp. 5182-91.
29. Weidle UH., Schneider B., Georges G. and Brinkmann U., (2012),
“Genetically engineered fusion proteins for treatment of cancer”, Cancer Genomics Proteomics. 2012 Nov, pp. 357-72.
30. Wu X., J. H. Bayle, D. Olson and Levine A. J., (1993), “The p53-mdm-2 autoregulatory feedback loop”, Genes Dev. 1993 Jul, pp. 1126-32. 31. Yan H., N. Liu, Z. Zhao, X. Zhang, H. Xu, B. Shao and Yan C. (2012),
“Expression and purification of human TAT-p53 fusion protein in Pichia pastoris and its influence on HepG2 cell apoptosis”. Biotechnol
Lett. 2012 Jul, pp. 1217-23.