Chú thích: M: thang chuẩn marker protein không màu; 1: dịch cặn; 2: Dịch tinh sạch; 3: dịch cô mẫu dịch thu; 4: Dịch thu ban đầu.
Từ kết quả điện di cho thấy khả năng tinh sạch của protein p53 thu được từ nuôi biểu hiện protein p53 trong chủng Pichia pastoris X33-36 cho kết quả như
mong đợi (dịch tinh sạch chỉ mang một băng duy nhất có kích thước 47kDa). Xuất hiện băng có kích thước lớn hơn 66,2kDa là protein của tế bào nấm men Pichia pastoris X33-36 tiết ra ngồi mơi trường mà không phải protein p53. Trong q trình cơ mẫu sử dụng cột cô vivaspin 20 chỉ loại bỏ được các protein có kích thước nhỏ hơn 30kDa. Vì vậy vẫn cịn lại protein này trong dịch cô. Tuy nhiên trong qua
trình tinh sạch, protein này đã bị loại bỏ hoàn toàn. Khả năng bám đặc hiệu của imidazol với protein ở pH=8.0 cao hơn so với kết quả sử dụng ở pH=6.0. Băng điện di cho sáng rõ ràng, khơng có sản phẩm phụ cũng như protein tạp trong dịch tinh sạch. Có thể sử dụng dịch tinh sạch này sử dụng tiếp cho q trình thử hoạt tính sinh học của protein p53 đối với khả năng ảnh hưởng của protein p53 tái tổ hợp này với khả năng ức chế tăng trưởng đối với tế bào của nó.
Thử nghiệm ở các nồng độ Imidazol trong dịch gắn cột N1 ở các nồng độ khác nhau cho kết quả như sau:
Hình 13: Kết quả điện di SDS-PAGE sản phẩm tinh sạch protein p53 ở các nồng độ Imidazol khác nhau.
Chú thích: 1: Dịch cặn; M: marker protein không màu; 2-6: tinh sạch ở các nồng độ imidazol khác nhau. 2: 0 mM, 3: 0,5 mM; 4: 1mM; 5: 5mM; 6: 7mM.
Kết quả cho thấy: với dịch gắn cột N1 có nồng độ imidazol 0 mM cho hiệu quả tinh sạch tốt, tuy nhiên vẫn còn xuất hiện băng phụ. Trong khi đó với nồng độ imidazol tăng lên 1 mM, 5mM và 7mM thì hiệu suất tinh sạch giảm dần rõ rệt, chứng tỏ ngồi protein p53 gắn vào gel thì imidazol cũng cạnh tranh 1 phần, vì vậy có 1 lượng protein p53 nhất định khơng gắn được với gel bị rửa trơi ra ngồi trong quá trình lên mẫu vào cột. Trong khi đó nồng độ 0,5 mM imidazol cho kết quả băng
66,2 kDa
với nồng độ protein tốt nhất, không chứa băng phụ. Tối ưu nhất cho tinh sạch mẫu protein p53 này.
So sánh khả năng tinh sạch và nồng độ mẫu giữa protein thu được ở 2 thí nghiệm ở pH=8 và pH=6, kết quả như sau:
Hình 14: Kết quả điện di SDS-PAGE sản phẩm protein thu được và sau tinh sạch ở 2 điều kiện pH 6.0 và 8.0
Chú thích: M: marker protein khơng màu; 1: dịch cô thu được; 2: dịch cặn; 3, 4: dịch tinh sạch ở pH=8; 5: dịch thô môi trường; 6: dịch cô thu được; 7, 9: dịch tinh sạch ở pH=6; 8: dịch cặn.
Kết quả thu được cho thấy protein thu được bằng phương pháp sử dụng pH=8 cho hiệu suất tinh sạch cao hơn, đạt nồng độ protein cao hơn so với phương pháp pH=6.
3.1.4. Kết quả định lượng protein bằng phương pháp Bradford
Để xác định hiệu suất tinh sạch qua cột Niken-Sepharose, hàm lượng protein trong các dịch mẫu theo các bước tinh sạch được xác định theo phương pháp Bradford. Kết quả đo mức hấp thụ ánh sáng OD595 nm (bảng 7) được ghi nhận sau 40 phút ủ ở nhiệt độ phịng được chúng tơi sử dụng để xây dựng đường chuẩn Bradford. Chỉ số tin cậy R2 đạt 0,9392 cho thấy đường chuẩn xây dựng được đạt độ tin cậy cao.
Bảng 7: Kết quả đo OD595 nm dựng đường chuẩn
mBSA (µg) 0 5 10 20 30 40 50
OD595 nm 0 0.34 0.46 0.622 0.83 0.95 1.102
Đường chuẩn Bradford xây dựng được có phương trình là y = 0.0198x + 0.1764.