37
Glutaraldehyde được lựa chọn làm chất trung gian để tạo liên kết. Do glutaraldehyde có 2 nhóm –CHO nên 1 nhóm sẽ liên kết với amin trên bề mặt wafer và 1 nhóm sẽ liên kết với nhóm amin trên thụ thể. Nhờ vậy thụ thể gắn được lên bề mặt của sợi Si-NW.
Hình 26: Lớp bề mặt của sợi trước khi gắn thụ thể là DNA.
Tiếp theo đó,Quy trình gắn thụ thể trên sợi Si-NW được tiến hành như sau:
Các thông số chi tiết của quy trình là:
SiNW
SiNW đãđược làm sạch
Lai với ssDNA
Đo dòngđiện
Ethanol,
Aceton e
Tạo liên kết H trên SiNW (H- Si, H-Si-H)
Tạo nhóm NH2 được bảo vệ
trên SiNW Khử nhóm chức bảo vệ NH2 SiNW gắn nhóm andehyde SiNW gắn thụ thể (PNA) HF, NH4F 10-N-BOC-amino- dec-1-en
TFA, methylene chloride
Rửa,
NH4OH glutaraldehyde
Rửa PNA, SSC
N-1-BOC-amino 3- cyclopentene
39
1. Khử SiO2 trên bề mặt SiNW để tạo liên kết Si-H bằng cách ngâm chip trong HF 1% trong 50’’ và NH4F 40% trong 60’’
2. Ngâm chip trong dung dịch 10-N-BOC-amino-dec-1-en trong điều kiện chiếu UV (254 nm) trong 3h
3. Rửa chip với chloroform trong 15’ ở 500 C và rửa lại bằng methanol 2 lần, mỗi lần 5’
4. Loại bỏ nhóm chức t-BOC bảo vệ amin bằng cách ngâm chip trong Trifluoroacetic acid (TFA) 2,5% với methylene chloride trong 2h
5. Ngâm chip trong NH4OH 10% trong 5’ và sau đó rửa bằng nước
6. Ngâm chip trong glutaraldehyde 1% (dung môi là nước) trong 1h và rửa bằng nước
7. Ủ chip với dung dịch gồm 10 uM PNA trong SSC 1X ở nhiệt độ phòng qua đêm
8. Loại bỏ những probes PNA không gắn kết bằng cách rửa chip với dung dịch SSC 1X 3 lần sau khi đã cố định PNA.
9. Lai chip với DNA mục tiêu trong dung dịch SSC.Tiến hành đo.
Trong cả 2 phương pháp thụ đơng hóa bề mặt nói trên, với từng loại nhóm chức trên bề mặt sợi silicon và tùy thuộc vào từng loại thụ thể cũng như sự biến đổi của thụ thể mà chúng tôi sẽ lựa chọn các hợp chất gắn kết trung gian phù hợp để gắn kết thụ thể lên trên sợisilicon.
Trong vài trường hợp chúng tơi có thể gắn trực tiếp thụ thể lên trên bề mặt sợi silicon mà không cần chất gắn kết trung gian. Tuy nhiên, phương pháp này hiệu quả sẽ thấp do việc gắn kết trực tiếp này có thể gây ra sự cản trở về không gian hoạt động cũng như sự biến tính một phần hay hoàn toàn của thụ thể làm giảm tính hoạt động của thụ thể. Do đó, việc dùng các hợp chất trung gian để gắn kết trở nên phổ biến hơn.Các hợp chất gắn kết trung gian được sử dụng thường là các hợp chất có nhóm chức kép.Sau bước gắn glutaraldehyde chip chứa sợi nano silicon được lai hoá với DNA tạo liên kết của nhóm NH2 trên DNA với nhóm CHO- trên glutaraldehyde, và chip như thế sẵn sang cho đo đạc, phát hiện DNA.
II.Định lượng DNA bằng cảm biến sinh học Si- NWs
Sau khi các sợi nano silicon đã được chế tạo ra và hoạt hóa bề mặt với lớp DNA, chíp được dùng để định lượng DNA ngoại lai của cây bắp chuyển gene. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành ly trích DNA của bắp chuyển gene và kiểm chứng, xác nhận bắp chuyển gene bằng kỹ thuật PCR. Sau đó dùng DNA này để thử nghiệm trên cảm biến sinh học Si-NWs. Nguyên nhân chúng tôi chọn đối tượng là DNA của cây bắp chuyển gen vì hiện nay đây là một trong các cây trồng chuyển gen phổ biến nhất ở Việt nam. Các cơ sở khoa học và kiến thức thu được trong việc phát hiện DNA của cây bắp chuyển gen sẽ được ứng dụng cho các đối tượng khác phức tạp hơn.
II.1. Ly trích DNA của bắp chuyển gene
Ly trích DNA của bắp chuyển gene từ hạt theo quy trình của Doyle và Doyle (1988) cải tiến.Quy trình gồm các bước:
1. Nghiền hạt bắp chuyển gene bằng nitơ lỏng, cho vào eppendorf. Thêm vào 1 ml dịch trích EB. Vortex, ủ ở 650 C trong 1 giờ
2. Ly tâm 5 phút 14000 vòng ở 100C. Hút lấy dịch nổi cho vào eppendorf mới. 3. Thêm 1 thể tích chloroform: isoamyl alcohol (24 : 1), trộn kỹ, ly tâm 5 phút
14000 vòngở 100C.
4. Chuyển lấy dịch trong lặp lại bước 3.
5. Chuyển lấy dịch trong, thêm vào 2 µl RNase,ủ ở 370 C trong 1giờ.
6. Thêm vào 0,6 thể tích dung dịch isopropanol lạnh. Để tủa ở –200C qua đêm. 7. Li tâm 5 phút 14000 vòngở 100C. Đổ bỏ dịch trong.
8. Cho vào 300 µl TE 1X,ủ ở 370C trong 1giờ.
9. Thêm 20 µl muối sodium acetate 3M, và 640 µl ethanol 100%, trộn đều và để – 200C trong 30 phút.
10. Li tâm 10 phút 14000 vòngở 40C, đổ bỏ dịch trong.
11. Rửa cặn với 400 µl ethanol 70% bằng cách ly tâm 2 phút 14000 vòng ở 100 C, đổ bỏ dịch trong.
12. Lặp lại bước 11. Để khơ cặn, hồ tan cặn trong 50 µl nước cất, ủ ở 370C đến khi cặn tan hết.Bảo quản mẫu ở 40C
13. DNA sau khi ly trích được điện di để kiểm tra việc ly trích có thành cơng hay khơng. Kết quả điện di được trình bày trong hình 26.
41
Hình 27: Sản phẩm ly trích DNA của bắp chuyển gene.
Hình 26 cho thấy DNA đã được ly trích thành cơng, các band DNA sáng, to và khơng bị đứt gãy (khơng có smear), điều này chứng tỏ DNA thu được có chất lượng rất tốt và nồng độ tương đối cao.
DNA được ly trích là 2 giống bắp chuyển gene của 2 công ty: giống 17850 của công ty Pioneer Hibred và giống Mon89034 của công ty Monsanto.
Xác định bắp chuyển gene bằng kỹ thuật PCR: Sau giai đoạn ly trích DNA,
chúng tơi tiến hành kiểm tra, xác định DNA ly trích là của giống bắp chuyển gene. Phương pháp xác định là sử dụng kỹ thuật PCR với quy trình như sau:
Bảng 1: Thành phần hóa chất trong phản ứng PCR
Hóa chất Nồng độ đầu Thể tích sử dụng Nồng độ cuối
Buffer 10 X 2,5 ul 1 X
MgCl2 25 mM 2,5 ul 2,5 mM
dNTP 10 mM 0,25 ul 100 uM
Primer xuôi 10 pmol/ul 1 ul 10 pmol
Primer ngược 10 pmol/ul 1 ul 10 pmol
Taq DNA polymerase
5 U 0,2 1 U
DNA mẫu 40 ng/ul 1 ul 40 ng
H2O 16,55 ul
Tổng thể tích 25 ul
Trong thành phần hóa chất chúng tơi sử dụng 2 primer có trình tự là: Primer xi: 5’ TCC TCT CCA AAT GAA ATG AAC TTC C 3’ Primer ngược: 5’CCA CGT CTT CAA AGC AAG TGG 3’
II.2. Phát hiện bắp chuyển gen bằng cảm biến Si-NWs DNA target: Trình tự DNA của cây bắp chuyển gen là:
3’- GGT GCA GAA GTT TCG TTC ACC – 5’ Do đó các thụ thể (receptor) có thể sử dụng là:
PNA: N - CCA CGT CTT CAA AGC AAG TGG– C DNA: 5' - CCA CGT CTT CAA AGC AAG TGG -3'
Tuy nhiên trong luận văn này chúng tôi sử dụng DNA: 5' - CCA CGT CTT CAA AGC AAG TGG -3' làm thụ thể cho việc phát hiện DNA cần phát hiện nói trên.
Lai DNA: Các DNA target được chuẩn bị trong dung dịch đệm SSC 0,5X. Sau
đó các dung dịch có chứa DNA target được cho chạy qua cảm biến SiNW đã có gắn kết các DNA receptor. Khi có sự kết cặp target-receptor sẽ làm thay đổi điện thế trên bề mặt sợi. Vì các sợi SiNW là loại P (có các hạt tải tích điện dương), nên khi có sự kết cặp với các DNA tích điện âm, sẽ làm tăng dòng điện qua mạch. Sự thay đổi dòng điện này được nghi nhận qua thiết bị điều khiển mạch ngồi (Hình 27).
Hình 28: Hệ thiết bị để tiến hành ghi lại sự thay đổi của dòng điện chạy
qua sợi bao gồm: thiết bị cấp dòng ( Agilent/HP 4155 C) kết nối với hệ probe station (EP6). Cả hệ được kết nối và điều khiển bằng máy tính. Có khả năng ghi nhận sự thay đổi dịngđiện đến cớ 100 fA.
43
Các thơng số củaquy trìnhđo đạc lànhư sau: Điện thế từ 40– 100 mV
Dòngđiện từ10– 100 nA
Điện thế biasing cho chíp: -20 V
Sự thay đổi của dòng điện chạy qua chíp được đo đạc và trình bày trong các hình 28-30. Ví dụ với chíp sạch ( khơng gắn thụ thể), chúng tơi quan sát khơng có sự thay đổi của dịngđiên, ( Hình 28).
Hình 28 : Đặc trưng I-t của chíp sạch (chip chưa biến đổi bề mặt sợi) cho thấy
dòng điệnqua sợi không thay đổikhi cho dung dịch chứa DNA đi qua.
trên) và chíp đã biến đổi bề mặt khi cho dung dịch chứa 1 nMDNA (đường I-t bên dưới).
Hình 29 cho thấy dòng điện đi qua chip thay đổikhi dung dịch chứa DNA đi qua chíp, điều này có nghĩa là sự lai giữa DNA target với thụ thể cố định trên sợi SiNW đã xảy ra. Sự lai xảy ra vào khoảng 300 giây sau khi dung dịch đã được cho đi qua chip và quá trình lai diễn ra trong khoảng 300 giây. Dòng điện tăng khoảng 5nA từ 80 ± 0.5 nA đến 84 ±0.5 nA. Sự tăng của dòng điện chứng tỏ cảm biến chế tạo ra đã ghi nhận được sự có mặt, hay phát hiện được DNA.
Tuy nhiên trong khuôn khổ, giới hạn về thời gian của luận văn này, chúng tôi chưa tiến hành đủ các thực nghiệm để nghiên cứu mối liên hệ giữa sự tăng/giảm của dòng điện qua sợi với nồng độ DNA. Kết quả này là rất quan trọng, vì nó cho phép phân tích định lượng được nồng độ DNA. Hiện nhóm nghiên cứu của PTN CNNN ĐHQG TP. HCM đang tiếp tục các thí nghiệm để hồn thành nội dung này.
45
KẾT LUẬN
Trong luận văn này chúng tôi đã:
Chế tạo được sợi nano silicon bằng phương pháp DEA, là phương pháp chỉ sử dụng các kĩ thuật của công nghệ micro, cho phép chế tạo các sợi nano silicon không quá đắt tiền.
Sợi chế tạo ra có kích thước nhỏ (chiều ngang 40 ± 5 nm), có tinh chất bề mặt và tính chất điện thích hợp cho việc sử dụng làm cảm biến sinhhọc.
Xây dựng được quytrình gắn thụ thể lên sợi Si-NWs
Kiểm tra được khả năng phát hiện DNA ngoại lai của chip Si-NW (ở nồng độ1nM).
Mặc dù chưa xây dựng được đường chuẩn để tiến hành định lượng nhưng qua khoá luận này cho thấy việc và định lượng DNA của chip SiNW là khả quan.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng việt
1. Hồ Huỳnh Thùy Dương, (2002). Sinh học phân tử. Nhà xuất bản giáo dục, trang 24-30; 122-124.
2. Trần Hồng Minh, bài giảng môn “Thiết kế vi hệ thống”.
3. Nguyễn Mạnh Tuấn bài giảng, “Công nghệ chế tạoVật liệu và Linh kiện cấu trúc nanô”.
Tài liệu tiếng anh 4. http://
ww.aacc.org/.../LiverTumorMarkerLMPG/.../LiverTumorMarkersCh2.pdf 5. Amy Pope-Harman et al., Biomedical Nanotechnology for Cancer, Med
Clin N Am 91 (2007) 899–927.
6. Choi, Y.-K.; Zhu, J.; Grunes, J.; Bokor, J.; Somorjai, G. A. J. Phys. Chem.
B (2003), 107, 3340.
7. Edwin T. Carlen and Albert van den Berg, “Nanowire electrochemical sensors: can we live without labels?”, Lab Chip, (2007), 7, 19 – 23.
8. E. M. Talavera, M. Afkir, R. Salto, A. M. Vargas, J. M. Alvarez-Pez, Fluorescence-labelled DNA probes to detect complementary sequences in homogeneous media, Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology 59 (2000) 9–14.
9. F. Patolsky, G. F. Zheng, O. Hayden, M. Lakadamyali, X.W. Zhuang, and C. M. Lieber, “Electrical detection of single viruses,” Proc. Nat. Acad. Sci. USA, vol. 101, pp. 14017–14022, (2004).
10. Gang Peng et al., Diagnosing lung cancer in exhaled breath using gold nanoparticles, Nature nanotechnology, Vol. 4, (October 2009), pp. 669- 673.
47
11. G.F. Zheng, F. Patolsky, Y. Cui, W.U. Wang and C.M. Lieber, “Multiplexed electrical detection of cancer markers with nanowire sensor arrays”, Nature biotechnology vol 23, number 10.
12. G Peng et al., Detection of lung, breast, colorectal, and prostate cancers from exhaled breath using a single array of nanosensors, Br J Cancer. (2010 July )
13. Hien Duy Tong, Songyue Chen, Wilfred G. van der Wiel, Edwin T. Carlen, and Albert van den Berg, “Novel Top-Down Wafer-Scale Fabricationof Single Crystal Silicon Nanowires”, Nanoletter , vol. 9, No.3, pp.1015-1022, (March, 2009).
14. Hyun-Seung Lee et al., Electrical detection of VEGFs for cancer
diagnoses using anti-vascular endotherial growth factor aptamer-modified Si nanowire FETs,, Biosensors and Bioelectronics 24 (2009) 1801–1805. 15. Jong-in Hahm and Charles M. Lieber, “Direct Ultrasensitive Electrical
Detection of DNA and DNA Sequence Variations Using Nanowire Nanosensors”, Nano Letter (2004), vol 4, No 1.
16. Kelly Y. Kim, Nanotechnology platforms and physiological challenges for cancer therapeutics, Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 3 (2007) 103–110.
17. L. Hood et al., Systems biology and new technologies enable predictive and preventative medicine, Science, 306, 640,( 2004).
18. Marco Curreli, Rui Zhang, Fumiaki N. Ishikawa, Hsiao-Kang Chang, Richard J. Cote, Chongwu Zhou, and Mark E. Thompson, “Real-Time, Label-Free Detection of Biological Entities Using Nanowire-Based FETs”, IEEE Transactions on nanotechnology, vol. 7, no. 6,( november 2008).
19. http://nano.cancer.gov/
20. Niranjan S. Ramgir et al., Voltammetric Detection of Cancer Biomarkers Exemplified by Interleukin-10 and Osteopontin with Silica Nanowires, J. Phys. Chem. C 2007, 111, 13981-13987.
21. S. Cross et al., Nanomechanical analysis of cells from cancer patients, Nature Nanotechnology, Vol.2,( 2007), 780- 783.
22. S. Niu, G. Singh and R. F. Saraf, Label-less fluorescence-based method to detect hybridization with applications to DNA micro-arra, Biosensors and Bioelectronics 23 (2007) 714–720.
23. T.M.C. Hoang: literature study on surface modification of silicon nanowires, Internal Report, Nanosens Research B.V., (2009).
24. Young-Eun Choi et al., Nanotechnology for Early Cancer Detection, Sensors, 428-455, (2010).
25. Wayne U. Wang, Chuo Chen, Keng-hui Lin, Ying Fang, and Charles M. Lieber, “Label-free detection of small-molecule–protein interactions by using nanowire nanosensors”, PNAS , (March 1, 2005) , Vol. 102 , No. 9, 3208–3212.