Hình 26 cho thấy DNA đã được ly trích thành công, các band DNA sáng, to và không bị đứt gãy (khơng có smear), điều này chứng tỏ DNA thu được có chất lượng rất tốt và nồng độ tương đối cao.
DNA được ly trích là 2 giống bắp chuyển gene của 2 công ty: giống 17850 của công ty Pioneer Hibred và giống Mon89034 của công ty Monsanto.
Xác định bắp chuyển gene bằng kỹ thuật PCR: Sau giai đoạn ly trích DNA,
chúng tơi tiến hành kiểm tra, xác định DNA ly trích là của giống bắp chuyển gene. Phương pháp xác định là sử dụng kỹ thuật PCR với quy trình như sau:
Bảng 1: Thành phần hóa chất trong phản ứng PCR
Hóa chất Nồng độ đầu Thể tích sử dụng Nồng độ cuối
Buffer 10 X 2,5 ul 1 X
MgCl2 25 mM 2,5 ul 2,5 mM
dNTP 10 mM 0,25 ul 100 uM
Primer xuôi 10 pmol/ul 1 ul 10 pmol
Primer ngược 10 pmol/ul 1 ul 10 pmol
Taq DNA polymerase
5 U 0,2 1 U
DNA mẫu 40 ng/ul 1 ul 40 ng
H2O 16,55 ul
Tổng thể tích 25 ul
Trong thành phần hóa chất chúng tơi sử dụng 2 primer có trình tự là: Primer xi: 5’ TCC TCT CCA AAT GAA ATG AAC TTC C 3’ Primer ngược: 5’CCA CGT CTT CAA AGC AAG TGG 3’
II.2. Phát hiện bắp chuyển gen bằng cảm biến Si-NWs DNA target: Trình tự DNA của cây bắp chuyển gen là:
3’- GGT GCA GAA GTT TCG TTC ACC – 5’ Do đó các thụ thể (receptor) có thể sử dụng là:
PNA: N - CCA CGT CTT CAA AGC AAG TGG– C DNA: 5' - CCA CGT CTT CAA AGC AAG TGG -3'
Tuy nhiên trong luận văn này chúng tôi sử dụng DNA: 5' - CCA CGT CTT CAA AGC AAG TGG -3' làm thụ thể cho việc phát hiện DNA cần phát hiện nói trên.
Lai DNA: Các DNA target được chuẩn bị trong dung dịch đệm SSC 0,5X. Sau
đó các dung dịch có chứa DNA target được cho chạy qua cảm biến SiNW đã có gắn kết các DNA receptor. Khi có sự kết cặp target-receptor sẽ làm thay đổi điện thế trên bề mặt sợi. Vì các sợi SiNW là loại P (có các hạt tải tích điện dương), nên khi có sự kết cặp với các DNA tích điện âm, sẽ làm tăng dòng điện qua mạch. Sự thay đổi dòng điện này được nghi nhận qua thiết bị điều khiển mạch ngồi (Hình 27).
Hình 28: Hệ thiết bị để tiến hành ghi lại sự thay đổi của dòng điện chạy
qua sợi bao gồm: thiết bị cấp dòng ( Agilent/HP 4155 C) kết nối với hệ probe station (EP6). Cả hệ được kết nối và điều khiển bằng máy tính. Có khả năng ghi nhận sự thay đổi dịngđiện đến cớ 100 fA.
43
Các thơng số củaquy trìnhđo đạc lànhư sau: Điện thế từ 40– 100 mV
Dòngđiện từ10– 100 nA
Điện thế biasing cho chíp: -20 V
Sự thay đổi của dòng điện chạy qua chíp được đo đạc và trình bày trong các hình 28-30. Ví dụ với chíp sạch ( khơng gắn thụ thể), chúng tơi quan sát khơng có sự thay đổi của dịngđiên, ( Hình 28).
Hình 28 : Đặc trưng I-t của chíp sạch (chip chưa biến đổi bề mặt sợi) cho thấy
dòng điệnqua sợi không thay đổikhi cho dung dịch chứa DNA đi qua.
trên) và chíp đã biến đổi bề mặt khi cho dung dịch chứa 1 nMDNA (đường I-t bên dưới).
Hình 29 cho thấy dòng điện đi qua chip thay đổikhi dung dịch chứa DNA đi qua chíp, điều này có nghĩa là sự lai giữa DNA target với thụ thể cố định trên sợi SiNW đã xảy ra. Sự lai xảy ra vào khoảng 300 giây sau khi dung dịch đã được cho đi qua chip và q trình lai diễn ra trong khoảng 300 giây. Dịng điện tăng khoảng 5nA từ 80 ± 0.5 nA đến 84 ±0.5 nA. Sự tăng của dòng điện chứng tỏ cảm biến chế tạo ra đã ghi nhận được sự có mặt, hay phát hiện được DNA.
Tuy nhiên trong khuôn khổ, giới hạn về thời gian của luận văn này, chúng tôi chưa tiến hành đủ các thực nghiệm để nghiên cứu mối liên hệ giữa sự tăng/giảm của dòng điện qua sợi với nồng độ DNA. Kết quả này là rất quan trọng, vì nó cho phép phân tích định lượng được nồng độ DNA. Hiện nhóm nghiên cứu của PTN CNNN ĐHQG TP. HCM đang tiếp tục các thí nghiệm để hồn thành nội dung này.
45
KẾT LUẬN
Trong luận văn này chúng tôi đã:
Chế tạo được sợi nano silicon bằng phương pháp DEA, là phương pháp chỉ sử dụng các kĩ thuật của công nghệ micro, cho phép chế tạo các sợi nano silicon không quá đắt tiền.
Sợi chế tạo ra có kích thước nhỏ (chiều ngang 40 ± 5 nm), có tinh chất bề mặt và tính chất điện thích hợp cho việc sử dụng làm cảm biến sinhhọc.
Xây dựng được quytrình gắn thụ thể lên sợi Si-NWs
Kiểm tra được khả năng phát hiện DNA ngoại lai của chip Si-NW (ở nồng độ1nM).
Mặc dù chưa xây dựng được đường chuẩn để tiến hành định lượng nhưng qua khoá luận này cho thấy việc và định lượng DNA của chip SiNW là khả quan.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng việt
1. Hồ Huỳnh Thùy Dương, (2002). Sinh học phân tử. Nhà xuất bản giáo dục, trang 24-30; 122-124.
2. Trần Hồng Minh, bài giảng môn “Thiết kế vi hệ thống”.
3. Nguyễn Mạnh Tuấn bài giảng, “Công nghệ chế tạoVật liệu và Linh kiện cấu trúc nanô”.
Tài liệu tiếng anh 4. http://
ww.aacc.org/.../LiverTumorMarkerLMPG/.../LiverTumorMarkersCh2.pdf 5. Amy Pope-Harman et al., Biomedical Nanotechnology for Cancer, Med
Clin N Am 91 (2007) 899–927.
6. Choi, Y.-K.; Zhu, J.; Grunes, J.; Bokor, J.; Somorjai, G. A. J. Phys. Chem.
B (2003), 107, 3340.
7. Edwin T. Carlen and Albert van den Berg, “Nanowire electrochemical sensors: can we live without labels?”, Lab Chip, (2007), 7, 19 – 23.
8. E. M. Talavera, M. Afkir, R. Salto, A. M. Vargas, J. M. Alvarez-Pez, Fluorescence-labelled DNA probes to detect complementary sequences in homogeneous media, Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology 59 (2000) 9–14.
9. F. Patolsky, G. F. Zheng, O. Hayden, M. Lakadamyali, X.W. Zhuang, and C. M. Lieber, “Electrical detection of single viruses,” Proc. Nat. Acad. Sci. USA, vol. 101, pp. 14017–14022, (2004).
10. Gang Peng et al., Diagnosing lung cancer in exhaled breath using gold nanoparticles, Nature nanotechnology, Vol. 4, (October 2009), pp. 669- 673.
47
11. G.F. Zheng, F. Patolsky, Y. Cui, W.U. Wang and C.M. Lieber, “Multiplexed electrical detection of cancer markers with nanowire sensor arrays”, Nature biotechnology vol 23, number 10.
12. G Peng et al., Detection of lung, breast, colorectal, and prostate cancers from exhaled breath using a single array of nanosensors, Br J Cancer. (2010 July )
13. Hien Duy Tong, Songyue Chen, Wilfred G. van der Wiel, Edwin T. Carlen, and Albert van den Berg, “Novel Top-Down Wafer-Scale Fabricationof Single Crystal Silicon Nanowires”, Nanoletter , vol. 9, No.3, pp.1015-1022, (March, 2009).
14. Hyun-Seung Lee et al., Electrical detection of VEGFs for cancer
diagnoses using anti-vascular endotherial growth factor aptamer-modified Si nanowire FETs,, Biosensors and Bioelectronics 24 (2009) 1801–1805. 15. Jong-in Hahm and Charles M. Lieber, “Direct Ultrasensitive Electrical
Detection of DNA and DNA Sequence Variations Using Nanowire Nanosensors”, Nano Letter (2004), vol 4, No 1.
16. Kelly Y. Kim, Nanotechnology platforms and physiological challenges for cancer therapeutics, Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 3 (2007) 103–110.
17. L. Hood et al., Systems biology and new technologies enable predictive and preventative medicine, Science, 306, 640,( 2004).
18. Marco Curreli, Rui Zhang, Fumiaki N. Ishikawa, Hsiao-Kang Chang, Richard J. Cote, Chongwu Zhou, and Mark E. Thompson, “Real-Time, Label-Free Detection of Biological Entities Using Nanowire-Based FETs”, IEEE Transactions on nanotechnology, vol. 7, no. 6,( november 2008).
19. http://nano.cancer.gov/
20. Niranjan S. Ramgir et al., Voltammetric Detection of Cancer Biomarkers Exemplified by Interleukin-10 and Osteopontin with Silica Nanowires, J. Phys. Chem. C 2007, 111, 13981-13987.
21. S. Cross et al., Nanomechanical analysis of cells from cancer patients, Nature Nanotechnology, Vol.2,( 2007), 780- 783.
22. S. Niu, G. Singh and R. F. Saraf, Label-less fluorescence-based method to detect hybridization with applications to DNA micro-arra, Biosensors and Bioelectronics 23 (2007) 714–720.
23. T.M.C. Hoang: literature study on surface modification of silicon nanowires, Internal Report, Nanosens Research B.V., (2009).
24. Young-Eun Choi et al., Nanotechnology for Early Cancer Detection, Sensors, 428-455, (2010).
25. Wayne U. Wang, Chuo Chen, Keng-hui Lin, Ying Fang, and Charles M. Lieber, “Label-free detection of small-molecule–protein interactions by using nanowire nanosensors”, PNAS , (March 1, 2005) , Vol. 102 , No. 9, 3208–3212.