I. Biến đổi bề mặt sợi Si-NWs
I.1 Tạo sự đồng nhất trên bề mặt sợi có lớp SiO2
Silane hóa thường là sự lựa chọn đầu tiên trong quy trình biến đổi bề mặt sợi silicon và một số tác nhân silane thương mại thường sử dụng là:
31
Hình 16 : Các chất sử dụng để silane hóa.
Khi silane hóa, cơ chế phản ứng xảy ra nhưsau:
Hình 17: Cơ chế phản ứng của quá trình silan hố.
Q trình silane hố được thực hiện bằng dung dịch APTES. Mục đích của q trình này là tạo một lớp có nhóm chức –NH2 trên bề măt của sợi.
Sau bước này bề mặt wafer silic sẽ có nhóm chức -NH2tự do. Việc rửa wafer trong ethanol tuyệt đối sẽ loại bỏ APTES không gắn kết lên trên wafer và ủ ở 1100C trong 1h sẽ làm bay hơi nước và ethanol, đồng thời tạo điều kiện để APTES gắn chặt hơn trên wafer.
Hình 18: Ảnh SEM của bề mặt wafer silic sau khi xử lý bằng dung dịch
APTES.
Vì lớp APTES sau khi phủ lên bề mặt wafer sẽ có dạng trong suốt khơng màu rất khó quan sát nên chúng tơi đã chụp ảnh tại vị trí ranh giới giữa lớp phủ và bề mặt để dễ nhận biết được sự hiện diện của lớp APTES trên bề mặt. So sánh kết quả ảnh SEM của bề mặt wafer trước và sau khi xử lý bằng dung dịch APTES với cùng độ phân giải, điện thế chúng tôi nhận thấy bề mặt đã được silan hóa nghĩa là lớp APTES đã phủ lên trên bề mặt wafer.
Do nhóm -NH2 trên bề mặt wafer khơng thể gắn trực tiếp với nhóm -NH2 có trên thụ thể. Vì vậy, glutaraldehyde được lựa chọn làm chất trung gian để tạo liên kết. Do glutaraldehyde có 2 nhóm –CHO nên 1 nhóm sẽ liên kết với amin trên bề mặt Si-NWs và 1 nhóm sẽ liên kết với nhóm amin trên thụ thể. Nhờ vậy thụ thể gắn được lên bề mặt của sợi Si-NWs.
33
Sau bước gắn glutaraldehydechúng tôi tiến hành gắn thụ thể lên sợi SiNW.
Để biết được glutaraldehyde đã được phủ trên wafer chưa, chúng tôi quan sát bề mặt của wafer bằng phương pháp SEM.
Hình 20: Ảnh SEM của bề mặt wafer sau khi xử lý bằng dung dịch
glutaraldehyde.
Sau khi gắn glutaraldehytechúng tôi tiến hành rửalại sợi để loại bỏ các phân tử glutaraldehyte không gắm vào sợi và tiến hành gắn thụ thể là DNA lên sợi. Gốc NH2 trong phân tử DNA sẽ gắn vị gốc- CHO tự do của
glutaraldehyte.
Hình 21: Sau khi gắn thụ thể là DNA.
Quy trình gắn thụ thể và đo đạc gồm các bước sau:
-CHO- NH2-DNA
Quy trìnhđược diễn giải như sau:
Bước 1: Làm sạch và tạo lới SiO2 trên sợi Si-NW bằng dung dịch
acetone, ethanol và oxygen plasma: 30W, 50 sccm O2 trong 60’’
Bước 2: Silane hóa bằng cách ngâm chip trong 2% APTES với dung
dịch ethanol 95% trong 2 h bước này để tạo nhóm chức NH2 trên sợi
Bước 3: Rửa chip bằng ethanol tuyệt đối 3 lần và làm khơ trong dịng khí
N2.Ủ ở điều kiện 1100 C trong 1h
SiNW
SiNW đãđược làm
sạch
SiNW đã Silan hóa
(có nhóm NH2)
SiNW gắn nhóm andehyde
SiNW gắn thụ thể (DNA)
Lai với ssDNA
Đo dịngđiện Ethanol, Acetone Oxygen plasma hóa APTES glutaraldehyde Rửa PNA, SSC Rửa, làm khơ
35
Bước 4: Ngâm chip trong dung dịch glutaraldehyde 5% (dung môi là nước) trong 1h và rửa với nước
Bước 5: Ủ chip với dung dịch gồm 10 uM thụ thể (DNA) nhiệt độ phòng qua
đêm (>= 12h)
Bước 6: Loại bỏ những thụ thể không gắn kết bằng cách rửa chip với
dung dịch SSC 1X 3 lần sau khi đã cố định thụ thể (mỗi lần 5’)
Bước 7: Bất hoạt nhóm andehyte khơng gắn thụ thể bằng cách ngâm chip trong dung dịch ethanolamine 100nM.
Bước 8: Rửa chip với đệm phosphate để loại bỏ các chất còn thừa trong bước 7, sau đó rửa lại bằng dung dịch SSC 1X để tạo môi trường cho việc
lai DNA cần phát hiện.
I.2. Tạo sự đồng nhất trên bề mặt sợi Si không có SiO2
Như đã trình bày ở trên, biosensor được chế tạo thường được phủ một lớp mỏng SiO2 trên bề mặt sợi Si-NWs. Do đó, chúng ta cần sử lý để loại bỏ lớp oxide tự nhiên này, tạo lớp Si đồng nhất trên bề mặt sợi. HF và NH4F là 2 tác nhân thường được sử dụng trong bước này, với cơ chế như sau:
Hình 22: Cơ chế khử lớp SiO2 trên mặt sợi Si-NWs.
Sau bước này trên bề mặt sợi silicon đã hoạt hóa có nhóm Si-Hx. Sau đó sensor được rửa bằng ethanol và aceton để loại bỏ các bụi bẩn sau đó ngâm trong dung dịch HF để loại bỏ lớp SiO2, sau bước này trên bề mặt sợi silicon có các liên kết Si-H. Sau đó ngâm chip trong dung dịch 10-N-BOC-amino-dec-1-
en trong điều kiện chiếu UV (254 nm) trong 3h để tạo ra trên bề mặt sợi có nhóm chức-NH2 .
Hình 23: Sợi silic sau khi gắn 10-N-BOC.
Tiếp theo sensor được loại bỏ nhóm chức t-BOC bảo vệ amin bằng cách ngâm chip trong Trifluoroacetic acid (TFA) 2,5% với methylene chloride trong 2h mục đích của bước này là loại bỏ các nhóm chưc bảo vệ -NH2 tạo ra sự liên kết Si-NH2.
Hình 24: Loại bỏ các nhóm chức bảo vệ gốc amin.
Sau khi lấy chip ra khỏi TFArửa lại bằng dung dịch NH4OH để loại bỏ các gốc không liên kết hoặc các chất không mong muốn.
37
Glutaraldehyde được lựa chọn làm chất trung gian để tạo liên kết. Do glutaraldehyde có 2 nhóm –CHO nên 1 nhóm sẽ liên kết với amin trên bề mặt wafer và 1 nhóm sẽ liên kết với nhóm amin trên thụ thể. Nhờ vậy thụ thể gắn được lên bề mặt của sợi Si-NW.
Hình 26: Lớp bề mặt của sợi trước khi gắn thụ thể là DNA.
Tiếp theo đó,Quy trình gắn thụ thể trên sợi Si-NW được tiến hành như sau:
Các thông số chi tiết của quy trình là:
SiNW
SiNW đãđược làm sạch
Lai với ssDNA
Đo dịngđiện
Ethanol,
Aceton e
Tạo liên kết H trên SiNW (H- Si, H-Si-H)
Tạo nhóm NH2 được bảo vệ
trên SiNW Khử nhóm chức bảo vệ NH2 SiNW gắn nhóm andehyde SiNW gắn thụ thể (PNA) HF, NH4F 10-N-BOC-amino- dec-1-en
TFA, methylene chloride
Rửa,
NH4OH glutaraldehyde
Rửa PNA, SSC
N-1-BOC-amino 3- cyclopentene
39
1. Khử SiO2 trên bề mặt SiNW để tạo liên kết Si-H bằng cách ngâm chip trong HF 1% trong 50’’ và NH4F 40% trong 60’’
2. Ngâm chip trong dung dịch 10-N-BOC-amino-dec-1-en trong điều kiện chiếu UV (254 nm) trong 3h
3. Rửa chip với chloroform trong 15’ ở 500 C và rửa lại bằng methanol 2 lần, mỗi lần 5’
4. Loại bỏ nhóm chức t-BOC bảo vệ amin bằng cách ngâm chip trong Trifluoroacetic acid (TFA) 2,5% với methylene chloride trong 2h
5. Ngâm chip trong NH4OH 10% trong 5’ và sau đó rửa bằng nước
6. Ngâm chip trong glutaraldehyde 1% (dung môi là nước) trong 1h và rửa bằng nước
7. Ủ chip với dung dịch gồm 10 uM PNA trong SSC 1X ở nhiệt độ phòng qua đêm
8. Loại bỏ những probes PNA không gắn kết bằng cách rửa chip với dung dịch SSC 1X 3 lần sau khi đã cố định PNA.
9. Lai chip với DNA mục tiêu trong dung dịch SSC.Tiến hành đo.
Trong cả 2 phương pháp thụ đơng hóa bề mặt nói trên, với từng loại nhóm chức trên bề mặt sợi silicon và tùy thuộc vào từng loại thụ thể cũng như sự biến đổi của thụ thể mà chúng tôi sẽ lựa chọn các hợp chất gắn kết trung gian phù hợp để gắn kết thụ thể lên trên sợisilicon.
Trong vài trường hợp chúng tơi có thể gắn trực tiếp thụ thể lên trên bề mặt sợi silicon mà không cần chất gắn kết trung gian. Tuy nhiên, phương pháp này hiệu quả sẽ thấp do việc gắn kết trực tiếp này có thể gây ra sự cản trở về không gian hoạt động cũng như sự biến tính một phần hay hoàn toàn của thụ thể làm giảm tính hoạt động của thụ thể. Do đó, việc dùng các hợp chất trung gian để gắn kết trở nên phổ biến hơn.Các hợp chất gắn kết trung gian được sử dụng thường là các hợp chất có nhóm chức kép.Sau bước gắn glutaraldehyde chip chứa sợi nano silicon được lai hố với DNA tạo liên kết của nhóm NH2 trên DNA với nhóm CHO- trên glutaraldehyde, và chip như thế sẵn sang cho đo đạc, phát hiện DNA.
II.Định lượng DNA bằng cảm biến sinh học Si- NWs
Sau khi các sợi nano silicon đã được chế tạo ra và hoạt hóa bề mặt với lớp DNA, chíp được dùng để định lượng DNA ngoại lai của cây bắp chuyển gene. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành ly trích DNA của bắp chuyển gene và kiểm chứng, xác nhận bắp chuyển gene bằng kỹ thuật PCR. Sau đó dùng DNA này để thử nghiệm trên cảm biến sinh học Si-NWs. Nguyên nhân chúng tôi chọn đối tượng là DNA của cây bắp chuyển gen vì hiện nay đây là một trong các cây trồng chuyển gen phổ biến nhất ở Việt nam. Các cơ sở khoa học và kiến thức thu được trong việc phát hiện DNA của cây bắp chuyển gen sẽ được ứng dụng cho các đối tượng khác phức tạp hơn.
II.1. Ly trích DNA của bắp chuyển gene
Ly trích DNA của bắp chuyển gene từ hạt theo quy trình của Doyle và Doyle (1988) cải tiến.Quy trình gồm các bước:
1. Nghiền hạt bắp chuyển gene bằng nitơ lỏng, cho vào eppendorf. Thêm vào 1 ml dịch trích EB. Vortex, ủ ở 650 C trong 1 giờ
2. Ly tâm 5 phút 14000 vòng ở 100C. Hút lấy dịch nổi cho vào eppendorf mới. 3. Thêm 1 thể tích chloroform: isoamyl alcohol (24 : 1), trộn kỹ, ly tâm 5 phút
14000 vòngở 100C.
4. Chuyển lấy dịch trong lặp lại bước 3.
5. Chuyển lấy dịch trong, thêm vào 2 µl RNase,ủ ở 370 C trong 1giờ.
6. Thêm vào 0,6 thể tích dung dịch isopropanol lạnh. Để tủa ở –200C qua đêm. 7. Li tâm 5 phút 14000 vòngở 100C. Đổ bỏ dịch trong.
8. Cho vào 300 µl TE 1X,ủ ở 370C trong 1giờ.
9. Thêm 20 µl muối sodium acetate 3M, và 640 µl ethanol 100%, trộn đều và để – 200C trong 30 phút.
10. Li tâm 10 phút 14000 vòngở 40C, đổ bỏ dịch trong.
11. Rửa cặn với 400 µl ethanol 70% bằng cách ly tâm 2 phút 14000 vòng ở 100 C, đổ bỏ dịch trong.
12. Lặp lại bước 11. Để khô cặn, hồ tan cặn trong 50 µl nước cất, ủ ở 370C đến khi cặn tan hết.Bảo quản mẫu ở 40C
13. DNA sau khi ly trích được điện di để kiểm tra việc ly trích có thành cơng hay khơng. Kết quả điện di được trình bày trong hình 26.
41
Hình 27: Sản phẩm ly trích DNA của bắp chuyển gene.
Hình 26 cho thấy DNA đã được ly trích thành cơng, các band DNA sáng, to và khơng bị đứt gãy (khơng có smear), điều này chứng tỏ DNA thu được có chất lượng rất tốt và nồng độ tương đối cao.
DNA được ly trích là 2 giống bắp chuyển gene của 2 công ty: giống 17850 của công ty Pioneer Hibred và giống Mon89034 của công ty Monsanto.
Xác định bắp chuyển gene bằng kỹ thuật PCR: Sau giai đoạn ly trích DNA,
chúng tôi tiến hành kiểm tra, xác định DNA ly trích là của giống bắp chuyển gene. Phương pháp xác định là sử dụng kỹ thuật PCR với quy trình như sau:
Bảng 1: Thành phần hóa chất trong phản ứng PCR
Hóa chất Nồng độ đầu Thể tích sử dụng Nồng độ cuối
Buffer 10 X 2,5 ul 1 X
MgCl2 25 mM 2,5 ul 2,5 mM
dNTP 10 mM 0,25 ul 100 uM
Primer xuôi 10 pmol/ul 1 ul 10 pmol
Primer ngược 10 pmol/ul 1 ul 10 pmol
Taq DNA polymerase
5 U 0,2 1 U
DNA mẫu 40 ng/ul 1 ul 40 ng
H2O 16,55 ul
Tổng thể tích 25 ul
Trong thành phần hóa chất chúng tơi sử dụng 2 primer có trình tự là: Primer xi: 5’ TCC TCT CCA AAT GAA ATG AAC TTC C 3’ Primer ngược: 5’CCA CGT CTT CAA AGC AAG TGG 3’
II.2. Phát hiện bắp chuyển gen bằng cảm biến Si-NWs DNA target: Trình tự DNA của cây bắp chuyển gen là:
3’- GGT GCA GAA GTT TCG TTC ACC – 5’ Do đó các thụ thể (receptor) có thể sử dụng là:
PNA: N - CCA CGT CTT CAA AGC AAG TGG– C DNA: 5' - CCA CGT CTT CAA AGC AAG TGG -3'
Tuy nhiên trong luận văn này chúng tôi sử dụng DNA: 5' - CCA CGT CTT CAA AGC AAG TGG -3' làm thụ thể cho việc phát hiện DNA cần phát hiện nói trên.
Lai DNA: Các DNA target được chuẩn bị trong dung dịch đệm SSC 0,5X. Sau
đó các dung dịch có chứa DNA target được cho chạy qua cảm biến SiNW đã có gắn kết các DNA receptor. Khi có sự kết cặp target-receptor sẽ làm thay đổi điện thế trên bề mặt sợi. Vì các sợi SiNW là loại P (có các hạt tải tích điện dương), nên khi có sự kết cặp với các DNA tích điện âm, sẽ làm tăng dịng điện qua mạch. Sự thay đổi dòng điện này được nghi nhận qua thiết bị điều khiển mạch ngồi (Hình 27).
Hình 28: Hệ thiết bị để tiến hành ghi lại sự thay đổi của dòng điện chạy
qua sợi bao gồm: thiết bị cấp dòng ( Agilent/HP 4155 C) kết nối với hệ probe station (EP6). Cả hệ được kết nối và điều khiển bằng máy tính. Có khả năng ghi nhận sự thay đổi dịngđiện đến cớ 100 fA.
43
Các thơng số củaquy trìnhđo đạc lànhư sau: Điện thế từ 40– 100 mV
Dòngđiện từ10– 100 nA
Điện thế biasing cho chíp: -20 V
Sự thay đổi của dòng điện chạy qua chíp được đo đạc và trình bày trong các hình 28-30. Ví dụ với chíp sạch ( khơng gắn thụ thể), chúng tơi quan sát khơng có sự thay đổi của dịngđiên, ( Hình 28).
Hình 28 : Đặc trưng I-t của chíp sạch (chip chưa biến đổi bề mặt sợi) cho thấy
dịng điệnqua sợi khơng thay đổikhi cho dung dịch chứa DNA đi qua.
trên) và chíp đã biến đổi bề mặt khi cho dung dịch chứa 1 nMDNA (đường I-t bên dưới).
Hình 29 cho thấy dịng điện đi qua chip thay đổikhi dung dịch chứa DNA đi qua chíp, điều này có nghĩa là sự lai giữa DNA target với thụ thể cố định trên sợi SiNW đã xảy ra. Sự lai xảy ra vào khoảng 300 giây sau khi dung dịch đã được cho đi qua chip và quá trình lai diễn ra trong khoảng 300 giây. Dòng điện tăng khoảng 5nA từ 80 ± 0.5 nA đến 84 ±0.5 nA. Sự tăng của dòng điện chứng tỏ cảm biến chế tạo ra đã ghi nhận được sự có mặt, hay phát hiện được DNA.
Tuy nhiên trong khuôn khổ, giới hạn về thời gian của luận văn này, chúng tôi chưa tiến hành đủ các thực nghiệm để nghiên cứu mối liên hệ giữa sự tăng/giảm của dòng điện qua sợi với nồng độ DNA. Kết quả này là rất quan trọng, vì nó cho phép phân tích định lượng được nồng độ DNA. Hiện nhóm nghiên cứu của PTN CNNN ĐHQG TP. HCM đang tiếp tục các thí nghiệm để hồn thành nội dung này.
45
KẾT LUẬN
Trong luận văn này chúng tôi đã:
Chế tạo được sợi nano silicon bằng phương pháp DEA, là phương pháp chỉ sử dụng các kĩ thuật của công nghệ micro, cho phép chế tạo các sợi nano silicon không quá đắt tiền.
Sợi chế tạo ra có kích thước nhỏ (chiều ngang 40 ± 5 nm), có tinh chất bề mặt và tính chất điện thích hợp cho việc sử dụng làm cảm biến sinhhọc.
Xây dựng được quytrình gắn thụ thể lên sợi Si-NWs
Kiểm tra được khả năng phát hiện DNA ngoại lai của chip Si-NW (ở nồng độ1nM).
Mặc dù chưa xây dựng được đường chuẩn để tiến hành định lượng nhưng qua khoá luận này cho thấy việc và định lượng DNA của chip SiNW là khả quan.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng việt
1. Hồ Huỳnh Thùy Dương, (2002). Sinh học phân tử. Nhà xuất bản giáo dục,