quản silica đường kính trong 75µm, chiều dài 60cm, chiều dài hiệu dụng 50cm, chiều cao bơm mẫu 25cm, thời gian bơm mẫu 30s.
Bảng 3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thế điện di đến diện tích pic (Spic) và thời gian di chuyển (tdc) của oxalate, tartrate và citrate
Thế điện di (kV)
Diện tích pic (mV.s) và thời gian di chuyển (s)
Oxalate Tartrate citrate
Spíc tdc Spíc tdc Spíc tdc -10 434,3 489,0 191,9 590,0 194,4 660,0 -15 260,1 318,0 121,0 371,0 113,4 408,0 -18 220,1 269,0 99,80 312,0 96,70 340,0 -20 192 243,0 79,30 280,0 77,60 305,0
Kết quả cho thấy, khi tăng thế áp vào hai đầu mao quản từ -10kV đến -20kV, thời gian phân tích giảm, khả năng tách giảm, tín hiệu nhiễu nền tăng lên. Tuy nhiên, khi thế tách thấp thì thời gian phân tích tăng lên, có thể làm giãn rộng pic. Do đó, thế tách đƣợc lựa chọn trong nghiên cứu này là -15kV để đảm bảo cho kết quả phân tích tốt nhất.
3.1.4. Khảo sát các chất ảnh hưởng
Các mẫu thực tế đƣợc lựa chọn có thể có các chất phụ gia, bảo quản thực phẩm nhƣ butyrate, formate, chloride. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của các chất này đến việc xác định hàm lƣợng các chất oxalate, tartrate, citrate đƣợc thể hiện trong hình 3.7.
Hình 3.7 Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của butyrate, formate 7,0.10-5
M, chloride 3,0.10-3M đến Oxalate, Citrate và Tartrate 1,0.10-5M. Các điều kiện phân tách khác
như hình 3.6.
Kết quả cho thấy chloride bắt đầu ảnh hƣởng đến pic oxalate ở nồng độ 3,0.10-3M, formate bắt đầu ảnh hƣởng đến pic tartrate ở nồng độ 7,0.10-5M và butyrate không ảnh hƣởng đến các chất phân tích. Do đó, trong trƣờng hợp các mẫu phân tích có hàm lƣợng các chất ảnh hƣởng nhƣ chloride (nồng độ > 3,0.10-3
M), formate (nồng độ > 7,0.10-5M) thì cần thiết phải pha lỗng mẫu. Tuy nhiên, thực tế khảo sát đối với các nền mẫu lựa chọn cho thấy các chất này có nồng độ nhỏ hơn ngƣỡng ảnh hƣởng.
3.2. Đánh giá phƣơng pháp phân tích
3.2.1. Lập đường chuẩn
Đƣờng chuẩn của ba chất oxalate, tartrate, citrate đƣợc thiết lập trên cơ sở điều kiện phân tích tối ƣu khảo sát đƣợc.
Các dung dịch dùng để dựng đƣờng chuẩn đƣợc pha loãng từ các dung dịch chuẩn gốc. Các dung dịch này có nồng độ biến thiên trong khoảng 2,5.10-6- 10-4M. Mỗi dung dịch đƣợc bơm trên thiết bị điện di 3 lần, giá diện tích pic trung bình đƣợc sử dụng để thiết lập đƣờng chuẩn sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ. Kết quả đƣợc thể hiện trong bảng 3.2.
700 600 500 400 300 200 100 0 50mV Chloride oxalate Tartrate Citrate Formate Butyrate
Bảng 3.3. Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ oxalate, tartrate, citrate
STT Nồng độ (1,0.10-6M)
Diện tích pic (mV.s)
Oxalate Tartrate Citrate
1 2,5 4,9 3,4 - 2 5,0 17 9,8 14 3 7,5 31 16 23 4 10 53 25 34 5 25 153 73 88 6 50 310 160 180 7 75 490 240 280 8 100 650 320 380
Từ kết quả thu đƣợc ở bảng 3.2, sử dụng phần mềm Origin để dựng đƣờng chuẩn và xử lý thống kê số liệu. Kết quả thu đƣợc nhƣ trên hình 3.8, hình 3.9, hình 3.10 và bảng 3.3. 0 20 40 60 80 100 0 100 200 300 400 500 600 700
Parameter Value Error
------------------------------------------------------------ A -15.57068 2.79364 B 6.66606 0.05742 ------------------------------------------------------------ R SD N P ------------------------------------------------------------ 0.99978 5.5919 8 <0.0001 DiƯ n tÝc h pic mV .S Nång ®é(x10-6M) B
Hình 3.8 Đường chuẩn của oxalate theo diện tích pic
Hình 3.9 Đường chuẩn của tartrate theo diện tích pic
Hình 3.10 Đường chuẩn của citrate theo diện tích pic
0 20 40 60 80 100 0 50 100 150 200 250 300 350
Parameter Value Error
------------------------------------------------------------ A -6.32142 1.1216 B 3.24353 0.02305 ------------------------------------------------------------ R SD N P ------------------------------------------------------------ 0.99985 2.24506 8 <0.0001 ------------------------------------------------------------ DiƯ n tÝch pic (mV. s) Nång ®é (x10-6M) B
Linear Fit of Data1_B
0 20 40 60 80 100 0 50 100 150 200 250 300 350 400
Parameter Value Error
------------------------------------------------------------ A -5.3452 1.11775 B 3.78318 0.02149 ------------------------------------------------------------ R SD N P ------------------------------------------------------------ 0.99992 1.96087 7 <0.0001 DiƯn tÝ ch pic (mV.s ) Nång ®é (x10-6M) B
Bảng 3.4. Phương trình đường chuẩn của oxalate, tartrate và citrate
Tên chất Phƣơng trình đƣờng chuẩn (y=a+bx) R2 oxalate y=(-15,570±2,79)+(6,6660±0,06)x 0,9996 tartrate y=(-6,321±1,12)+(3,2435±0,02)x 0,9997 citrate y=(-5,3452±1,12)+(3,7832±0,02)x 0,9999
Với kết thu đƣợc ở trên cho thấy, các hệ số tƣơng quan biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ chất phân tích là khá tốt (R2 ≥ 0,999), đồng thời các giá trị P < 0,05 (đối với cả 3 chất phân tích) chứng tỏ x và y có quan hệ tuyến tính.
Đánh giá phƣơng trình hồi qui của đƣờng chuẩn *Kiểm tra sự sai khác của a với giá trị 0
Phƣơng trình hồi quy có dạng: y = a + bx
Nếu xem a ≈ 0 thì phƣơng trình trên đƣợc viết thành dạng yi = b’xi thay các giá trị yi, xi tƣơng ứng vào ta đƣợc
𝑏 = 𝑖 ′ 𝑏𝑖 𝑛 − 1 𝑆𝑦2 = 𝑦𝑖 − 𝑦 𝑖 2 𝑛 − 2 = 𝑦𝑖 − 𝑎 − 𝑏𝑥𝑖 2 𝑛 − 2 𝑆′𝑦2 = 𝑦𝑖 − 𝑦′ 𝑖 2 𝑛 − 3 = 𝑦𝑖 − 𝑏 𝑥𝑖 ′ 𝑖 2 𝑛 − 3 Ta có Ftính= 𝑆𝑦 2 𝑆′𝑦2; F(0,95;6;7) =4,2067; F(0,95;5;6) = 4,95 Các giá trị tính tốn thu đƣợc thể hiện trong bảng 3.4.
Bảng 3.5. Kết quả so sánh giữa giá trị a với giá trị 0 của phương trình đường chuẩn oxalate, tartrate, citrate
Tên chất oxalate tartrate citrate
𝑏𝑖′ 5,0040 2,5564 2,7273
𝑆𝑦2 3,1325 2,0054 0,55400
𝑆′𝑦2 4,3347 3,5041 0,65740
Ftính 1,3838 1,7473 1,1866
Nhƣ vậy, Ftính< Fbảng nên khơng có sự khác nhau có ý nghĩa thống kê giữa a và 0, tức là phƣơng pháp không mắc sai số hệ thống.
3.2.2. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp
Để có kết luận chính xác về khoảng tuyến tính, chúng tơi tiến hành xác định các giá trị LOD và LOQ của phƣơng pháp:
Giới hạn phát hiện (LOD)
Để xác định giá trị LOD, dùng dung dịch chuẩn của các chất phân tích tiến hành pha lỗng với nồng độ nhỏ nhất mà vẫn thu đƣợc tín hiệu gấp 3 lần so với nhiễu đƣờng nền (S/N=3). Nồng độ ban đầu của hỗn hợp chất chuẩn đƣợc lựa chọn cho cả ba chất oxalate, tartrate và citrate là 5.10-5M, sau đó tiến hành pha loãng nồng độ nhỏ dần và phân tích điện di. Các kết quả thu đƣợc thể hiện trong bảng 3.6.
Bảng 3.6. Giới hạn phát hiện oxalate, tartrate và citrate bằng phương pháp điện di mao quản CE-C4D
C
(10-6M) Chất Chiều cao pic (S)
Tín hiệu nhiễu đƣờng nền (N) S/N 5 Oxalate 0,3843 0,04750 8,090 Tartrate 0,3577 7,530 citrate 0,2157 4,540 2,5 Oxalate 0,3039 0,06860 4,430 Tartrate 0,2655 3,870 citrate - -
Nhƣ vậy, giới hạn phát hiện (LOD) theo phƣơng pháp trực tiếp của oxalate, tartrate là 2,5.10-6M và của citrate là 5,0.10-6M.
Giới hạn định lượng (LOQ)
Theo lý thuyết thống kê trong hóa phân tích thì LOQ là nồng độ chất phân tích mà cho tín hiệu gấp 10 lần tín hiệu đƣờng nền (S/N=10). Vì vậy, giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp xác định oxalate, tartrate, citrate tƣơng ứng là 8,3.10-6M; 8,3.10-6M và 1,7.10-5
M. Từ đó, có thể xác định khoảng tuyến tính của phƣơng pháp CE-C4D xác định các chất oxalate, tartrate, citrate nhƣ trong bảng 3.7. Trong đó, giá trị cận trên của khoảng tuyến tính cịn có thể tiếp tục tăng nữa, tuy nhiên trong nghiên cứu này chúng tôi chỉ lựa chọn là 7,5.10-5
M để phù hợp với các đối tƣợng mẫu phân tích đã lựa chọn.
Bảng 3.7. Giá trị khoảng tuyến tính và LOD, LOQ của oxalate, tartrate, citrate
Chất phân tích Khoảng tuyến tính LOD LOQ
oxalate 8,3.10-6M – 7,5.10-6M 2,5.10-6M 8,3.10-6M
tartrate 8,3.10-6M – 7,5.10-6M 2,5.10-6M 8,3.10-6M
citrate 17.10-6M– 75.10-6M 5,0.10-6M 17.10-6M
3.2.3. Đánh giá độ chụm (độ lặp lại) độ đúng (độ thu hồi)
Độ chụm của thiết bị
Để đánh giá độ chụm của phƣơng pháp, chúng tôi tiến hành khảo sát độ lặp lại của oxalate, tartrat và, citrate ở 3 mức nồng độ 1,0.10-5M; 5,0.10-5M; 7,5.10-5M. Mỗi mức nồng độ đƣợc tiến hành với 6 lần bơm mẫu độc lập. Kết quả thu đƣợc trình bày trong bảng 3.7, 3.8 và 3.9.
Bảng 3.8. Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp CE-C4D trong định lượng oxalate
1,0.10-5M 5,0.10-5M 7,5.10-5M 1 55,0 306 488 2 53,7 310 498 3 54,1 308 476 4 53,1 312 491 5 52,3 309 496 6 52,5 317 490 Spic trung bình 53,5 310 489 RSD (%) 1,91 1,23 1,58
Bảng 3.9. Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp CE-C4D trong định lượng tartrate
Lần bơm mẫu
Diện tích pic ở các mức nồng độ của tartrate 1,0.10-5M 5,0.10-5M 7,5.10-5M 1 26,0 146 240 2 24,5 147 235 3 25,0 141 236 4 25,3 142 240 5 24,6 146 231 6 25,5 145 240 Spic trung bình 25,2 144 237 RSD (%) 2,26 1,68 1,56
Bảng 3.10. Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp CE-C4D trong định lượng citrate
1,0.10-5M 5,0.10-5M 7,5.10-5M 1 21,9 169 275 2 20,8 166 277 3 22,1 169 275 4 21,0 166 290 5 21,2 167 270 6 21,1 171 281 Spic trung bình 21,4 168 278 RSD (%) 2,46 1,19 2,47
Từ bảng kết quả cho thấy, ở cả 3 mức nồng độ đều có độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD) < 3% nằm trong giới hạn cho phép ở cỡ hàm lƣợng ppm. Nhƣ vậy phƣơng pháp có độ lặp lại tốt.
Độ đúng của phương pháp
Ngồi độ lặp lại thì độ đúng là một yếu tố để đánh giá phƣơng pháp phân tích. Độ đúng của phƣơng pháp đƣợc đánh giá qua hiệu suất thu hồi của phƣơng pháp phân tích, bao gồm cả xử lý và đo mẫu phân tích. Nó cho biết lƣợng chất bị mất đi trong quá trình xử lý mẫu. Đánh giá hiệu suất thu hồi là đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp xử lý mẫu đã lựa chọn.
Trong các thực phẩm nói chung và các mẫu thực phẩm đƣợc lựa chọn thƣờng có thành phần hóa học phức tạp, rất khó có thể tìm đƣợc mẫu trắng có thành phần nền giống nhƣ mẫu thực nhƣng khơng chứa chất phân tích. Vì vậy, để đánh giá độ thu hồi của phƣơng pháp, chúng tôi sử dụng phƣơng pháp thêm chuẩn, hỗn hợp chất chuẩn oxalate, tartrate và citrate đƣợc thêm vào nền mẫu thử là mẫu bia chai Hà Nội.
Quá trình đánh giá đƣợc thực hiện ở 4 mức thêm chuẩn khác nhau. + Mức 0: Chƣa thêm hỗn hợp dung dịch chuẩn vào 1000 µL mẫu thử
+ Mức 1: Thêm 30µL hỗn hợp dung dịch chuẩn ba chất nồng độ 10-3M vào 970µL mẫu thử
+ Mức 2: Thêm 60µL hỗn hợp dung dịch chuẩn ba chất nồng độ 10-3M vào 940 µL mẫu thử
+ Mức 3: Thêm 90µL hỗn hợp dung dịch chuẩn ba chất nồng độ 10-3M vào 910 µL mẫu thử
Mẫu thử đƣợc pha nhƣ sau:
Mẫu bia chai Hà Nội đƣợc rung siêu âm, sau đó lọc qua màng lọc 0,45µm, Pha lỗng 20 lần bằng nƣớc đề ion.
Mỗi mẫu thử đƣợc đo lặp lại 3 lần. Kết quả thu đƣợc trình bày ở bảng 3.11, bảng 3.12 và bảng 3.13.
Bảng 3.11. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp dựa trên thêm chuẩn oxalate
Mức 1 Mức 2 Mức 3
Nồng độ oxalate chuẩn thêm vào (1,00.10-5M) 3,00 6,00 9,00 Nồng độ oxalate thu hồi đƣợc (1,00.10-5M) 2,85 6,24 87,0
Hiệu suất thu hồi (%) 95,0 104 96,7
Hiệu suất thu hồi trung bình (%) 98,6
Bảng 3.12. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp dựa trên thêm chuẩn tartrate
Mức 1 Mức 2 Mức 3
Nồng độ tartrate chuẩn thêm vào (1,00.10-5M) 3,00 6,00 9,00 Nồng độ tartrate thu hồi đƣợc (1,00.10-5M) 2,91 5,94 9,09
Hiệu suất thu hồi (%) 97,0 99,0 101
Bảng 3.13. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp dựa trên thêm chuẩn citrate
Mức 1 Mức 2 Mức 3
Nồng độ citrate chuẩn thêm vào (1,00.10-5M) 3,00 6,00 9,00 Nồng độ citrate thu hồi đƣợc (1,00.10-5M) 2,85 6,36 8,82
Hiệu suất thu hồi (%) 95,0 106 98,0
Hiệu suất thu hồi trung bình (%) 99,7
Các kết quả thu đƣợc ở bảng 3.10 - 3.12 với độ thu hồi của oxalate, tartrate và citrate khá cao, từ 98,4÷99,7%, cho thấy phƣơng pháp có độ đúng cao. Từ các kết quả nghiên cứu thu đƣợc cho thấy qui trình phân tích đã đáp ứng đƣợc các u cầu về độ lặp lại và độ thu hồi trong phân tích lƣợng nhỏ các hợp chất hữu cơ trong nền mẫu phức tạp. Độ lệch chuẩn tƣơng đối của các chất phân tích (RSD) nhỏ hơn 3, độ thu hồi của các chất phân tích trong khoảng 98,6÷99,7%. Với quy trình phân tích này chúng tơi áp dụng phƣơng pháp CE-C4D để phân tích một số đối tƣợng mẫu thực tế.
3.3. Phân tích mẫu thực tế
3.3.1. Phân tích mẫu bia
Các mẫu bia đƣợc lựa chọn bao gồm một số loại bia chai và bia lon.Thông tin về các mẫu dƣợc phẩm này đƣợc nêu trong bảng 3.14.
Bảng 3.14. Thông tin và đặc điểm của từng loại bia
Tên sản phẩm Đặc điểm Xuất xứ
Bia chai Hà Nội Dạng thành phẩm: Đóng chai Dung tích: 450ml
Tổng cơng ty rƣợu bia nƣớc giải khát Hà Nôi
Bia lon Hà Nội Dạng thành phẩm: Đóng lon