CHƯƠNG 2 : THỰC NGHIỆM
2.2. KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ
2.2.1. Khảo sát tốc độ dòng
Đối với sắc ký lỏng, tốc độ dịng dung mơi là yếu tố vô cùng quan trọng quyết định đến q trình tách các chất phân tích ra khỏi nhau trong hỗn hợp của nó. Để khảo sát và tìm được tốc độ dịng tối ưu áp dụng cho phương pháp, tiến hành thay đổi tốc độ dòng trong khi các điều kiện khác được giữ cố định bằng cách tham khảo báo cáo đã được công bố [32]. Cụ thể, tiến hành khảo sát với hai giá trị tốc độ dòng khác nhau đó là 0,1; 0,2; 0,3 và 0,6 mL/phút. Mẫu được bơm với thể tích 10µL với hệ dung mơi là (A): AcOH 0.05%, (B): MeOH. Kết quả thu được sắc ký đồ như hình 4: Sắc ký đồ của 7 chất chuẩn paraben với các tốc độ dòng khác nhau.
2.2.2. Khảo sát tỉ lệ hệ dung mơi
Sau khi tìm được tốc độ dịng tối ưu, hệ dung mơi tiếp tục được nghiên cứu thay đổi tỉ lệ và chương trình chạy nhằm tìm chương trình tốt nhất cho quá trình tách sắc ký. Sau khi tham khảo một số báo cáo trước đó, hai hệ dung mơi áp dụng
để tiến hành khảo sát là: Hệ I: (A): AcOH 0,05% trong MeOH, (B): MeOH và hệ II (A): 0,32 g NH4HCOO, 1mL HCOOH, 20mL MeOH trong H2O; (B): 0,32 g NH4HCOO, 1mL HCOOH, 20 mL H2O trong MeOH. Hai hệ dung môi được thay đổi với chương trình chạy giữ cố định các điều kiện khác sao cho thu được kết quả tách tốt nhất.
Kết quả thu được các sắc ký đồ như hình 5: Sắc ký đồ của 7 chất chuẩn paraben với hai hệ dung môi khác nhau
2.2.3. Khảo sát điều kiện phân mảnh và định lượng trên detector khối phổ.
Sau khi khảo sát các điều kiện sắc ký bằng cách chạy Scan hỗn hợp các chất chuẩn paraben. Cùng với việc tham khảo các tài liệu công bố trước đó [32] các mảnh ion được lựa chọn để định lượng cho các paraben được chỉ ra như bảng sau:
Bảng 2. 1. Mảnh ion của các paraben
Paraben
Mảnh định lượng (m/z)
Mảnh ion mẹ Mảnh ion con
MeP 151(157) 92(98) EtP 165,0 92,0 IsoPrP 179,0 92,0 n-PrP 179,0 92,0 BuP 193(199) 92(98) HepP 235,0 92,0 BzP 227,0 92,0 2.3. THU MẪU
Mẫu bụi được thu tại các vi môi trường trong nội đô Hà Nội, khoảng thời gian tháng 6 đến tháng 12 năm 2019. Các vi môi trường được lựa chọn là: Phịng ngủ, phịng khách, bếp của nhà riêng, salon tóc, các cơ sở làm đẹp, spa hoặc phịng
thí nghiệm. Diện tích các các phịng khoảng 10-35 m3. Đặc điểm các phịng thu mẫu
đều có nhiều vật dụng những nơi thường xuyên có sự xuất hiện của nhiều người và có khả năng phơi nhiễm lớn nhất đối với con người.
Mẫu được thu trực tiếp (bằng cách dung chổi hoặc máy hút bụi) tại điểm thu mẫu và được gói bằng alumium foil rồi đem về xử lý. Tiếp theo, mẫu bụi được ray qua sàng có kích thước lỗ sàng là 0,05 mm và đựng trong ống falcon bảo quản trong
tủ lạnh với nhiệt độ 4oC cho đến khi phân tích.
Bảng 2. 2. Bảng thông tin mẫu bụi.
Ký hiệu mẫu Vi môi trường
HHN30 Phòng ngủ HHN33 Phòng ngủ HHN35 Phòng ngủ HHN47 Phòng ngủ HHN49 Phòng ngủ HD03 Nhà bếp HD04 Nhà bếp HD05 Nhà bếp HD09 Nhà bếp HD11 Nhà bếp HD12 Phòng khách HD13 Phòng khách HD14 Phòng khách HD15 Phòng khách HD16 Phòng khách HD17 Phòng khách HD18 Phịng khách 2.4. XỬ LÍ MẪU
Quy trình xử lý mẫu thường được áp dụng cho mẫu bụi đó là mẫu được chiết với các dung mơi chiết thích hợp. Tiếp theo, thu lấy dịch chiết và tiến hành làm sạch trên cột chiết pha rắn và thực hiện việc rửa giải bằng dung môi. Sau đó, làm giàu dịch chiết bằng cách cơ đặc và tiến hành phân tích trên thiết bị sắc ký.
Để có được quy trình tối ưu để xác định đồng thời bảy paraben điển hình trong mỗi bụi, một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chiết cần được khảo sát. Trong nghiên cứu này các yếu tố ảnh hưởng được lựa chọn để khảo sát độc lập (khi cố định các yếu tố khác) bao gồm: thay đổi tỷ lệ dung mơi chiết; thể tích dung mơi rửa giải;
2.4.1. Khảo sát dung môi chiết
Dung môi để chiết các hợp chất từ mẫu bụi phải đảm bảo các yêu cầu sau: + Dung mơi để chiết phải hịa tan tốt chất được chiết và kém hòa tan các tạp chất.
+ Dung môi này phải khơng tương tác hóa học với chất được chiết và có nhiệt độ sơi thích hợp.
+ Dung mơi được lựa chọn cũng phải phù hợp để đảm bảo việc đo trong các kỹ thuật phân tích cơng cụ.
Dung môi chiết (dự kiến): hỗn hợp dung môi methanol và nước. Sau đó, thay đổi tỉ lệ nước, methanol khác nhau như 1:1; 2:5 hoặc 1:5. Sử dụng các tỉ lệ dung môi chiết khác nhau và tiến hành với mẫu trắng (Na2SO4) sau khi đã được thêm các
chất chuẩn paraben và các chất đồng hành 13C-paraben và khảo sát độ thu hồi của
các chất khi chiết với các tỉ lệ methanol, nước khác nhau nhằm tìm ra tỉ lệ dung mơi tối ưu để thu được độ thu hồi tốt nhất.
2.4.2. Khảo sát thể tích dung mơi dùng để rửa rải
Sau khi thu được dịch chiết mẫu, công việc quan trọng tiếp theo trong quá trình xử lý mẫu đó là làm sạch và làm giàu chất phân tích có trong dịch chiết. Phương pháp tối ưu và đáp ứng cả 2 mục đích là làm sạch và làm giàu mà ngày nay được các nhà phân tích sử dụng rất nhiều đó là phương pháp chiết pha rắn (SPE –
Solid Phase Extraction). Sử dụng cột chiết pha rắn Oasis MCX (60 mg/cm3) để tiến
hành tinh chế dịch chiết. Hoạt hóa cột chiết với 5 mL methanol và 5 mL nước cất. Tiếp theo cho dịch chiết lên cột và làm sạch bằng cách thêm 5mL MeOH:H2O (20:80, V:V) và 3 mL nước cất. Rửa giải chất phân tích bằng MeOH. Cũng tiến hành tương tự như khi khảo sát tỉ lệ dung môi chiết và dùng các thể tích dung dịch rửa rải khác nhau như: 5, 10, 15 mL methanol để tìm được thể tích tối ưu có thể rửa rải hết chất phân tích ra khỏi cột mà vẫn tiết kiệm lượng dung môi sử dụng.
Nhằm đánh giá độ tinh khiết của dung môi và dụng cụ thí nghiệm có đảm bảo cho q trình phân tích khơng bị sai số do phơi nhiễm chất phân tích, mẫu trắng được chuẩn bị bằng cách dùng 200mg Na2SO4 để làm mẫu trắng và được xử lý và tiến hành sắc ký theo các điều kiện đã được tối ưu trước đó. Ngồi ra, các mẫu này được bơm liên tục để xác nhận rằng các chất chuẩn paraben đã được rửa rải hoàn toàn ra khỏi hệ thống sau mỗi lần chạy. Kết quả được chỉ ra ở bảng 3.3.
2.5. XÁC NHẬN GIÁ TRỊ SỬ DỤNG CỦA PHƯƠNG PHÁP
2.5.1. Xác định LOD, LOQ của phương pháp:
Khi đã lựa chọn được các mảnh ion dùng để định lượng paraben và các yếu tố điều kiện sắc ký khác, giới hạn phát hiện của thiết bị ̣(IDL) và giới hạn định lượng của thiết bị (IQL) được xác định từ thực nghiệm bằng cách tiến hành pha các nồng độ từ cao đến thấp với mỗi paraben sau đó bơm từng nồng độ thấp dần vào máy. Đến khi thu được tín hiệu cao gấp khoảng 3 lần đường nền thì từ giá trị nồng độ bơm vào máy khi đó kết hợp với thể tích dung dịch chuẩn được bơm vào máy có thể xác định giới hạn phát hiện của thiết bị (IDL) đối với từng paraben. Từ giá trị IDL vừa xác định được có thể xác định giá trị giới hạn định lượng của thiết bị (IQL) theo công thức: IQL = IDL x 3. Kết quả khảo sát được đưa ra trong mục 3 tại bảng 3.2. IDL và IQL của paraben. Tiếp theo, giới hạn phát hiện của phương pháp (MDL) hay còn gọi là LOD được xác định dựa trên IDL kết hợp với khối lượng mẫu và quá trình xư lý mẫu (pha lỗng, cơ đặc,….). Giới hạn định lượng của phương pháp (MQL) hay LOQ được xác định theo công thức: MQL = 3 x MDL. Kết quả được đưa ra ở bảng 3.7. MDL và MQL của các paraben.
2.5.2. Dựng đường chuẩn
Tiếp theo, sau khi các điều kiện thích hợp của thiết bị để phân tích định lượng paraben đã được xác định. Tiến hành xây dựng đường chuẩn cho từng paraben với dãy nồng độ chất chuẩn được pha như ở mục 2.1.1 và với mỗi điểm nồng độ trong đường chuẩn được bơm lặp lại. Kết quả thu được đường chuẩn đưa ra trong mục 3 tại Bảng 3.6. Phương trình đường chuẩn của các paraben và phụ lục 1: Đường chuẩn của các paraben. Yêu cầu của phương pháp phân tích đối với đường
chuẩn đó là đường chuẩn phải có hệ số hồi quy tuyến tính R2 ≥ 0,995.
Nhằm đánh giá giá trị sử dụng của phương pháp có thể áp dụng để định lượng paraben trong mẫu bụi hay không độ lặp lại và độ đúng của phương pháp đã được khảo sát như sau: Tiến hành đồng thời 7 mẫu thêm chuẩn tại điểm 10 µg/L
vào mẫu trắng ̣̣(Na2SO4) bằng cách hút chính xác 1mL dung dịch chuẩn hỗn hợp 10
µg/L thêm vào mẫu trắng trộn đều, để ổn định trong khoảng 30 phút. Tiến hành xử lý theo quy trình đã được chuẩn hóa và đo mẫu song song với mẫu trắng (Na2SO4). Sau đó, đưa ra hàm lượng thực tế thu được (đã trừ mẫu trắng) sau quá trình xử lý mẫu và tiến hành sắc ký nhằm xác định độ thu hồi của phương pháp. Bên cạnh đó, cũng xác định độ lệch chuẩn tương đối (RSD) nhằm đánh giá độ lặp lại của phương pháp. Kết quả thu được của độ thu hồi và độ lặp lại phải đáp ứng được yêu cầu của phương pháp theo AOAC khuyến nghị:
Bảng 2. 3. Độ lặp lại và độ thu hồi chấp nhận dựa trên các nồng độ khác nhau
Nồng độ RSDr (độ lặp lại) Độ thu hồi (%) 100% 1.3 98-102 10% 1.9 98-102 1% 2.8 97–103 0.10% 3.7 95–105 100 ppm 5.3 90–107 10 ppm 7.3 80–110 1 ppm 11 80–110 100 ppb 15 80–110 10 ppb 21 60–115 1 ppb 30 40–120
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH
3.1.1. Điều kiện phân tích sắc ký
Sau quá trình khảo sát các tốc độ dòng khác nhau và giữ nguyên các điều kiện sắc ký khác thu được kết quả như sau:
Hình 3. 1: Sắc ký đồ của 7 chất chuẩn paraben với các tốc độ dòng khác nhau Từ hình trên có thể thấy, với tốc độ dòng là 0,6 mL/phút thời gian lưu của Từ hình trên có thể thấy, với tốc độ dòng là 0,6 mL/phút thời gian lưu của các paraben giảm dẫn tới có thể giảm thời gian phân tích. Tuy nhiên, peak của PrP và IsoPrP là hai đồng phân hình học bị chập và hình dạng các peak khơng được cân đối. Ngồi ra, cường độ tín hiệu và diện tích peak thấp. Thay vào đó, với tốc độ
dòng là 0,1; 0,2 và 0,3 mL/phút thì hai peak của PrP và IsoPrP khơng cịn bị chập.
Hơn nữa diện tích peak, cường độ tín hiệu cũng được cải thiện và hình dạng peak cũng cân đối. Từ đó, chọn tốc độ dịng là 0,3 mL/phút để có được tín hiệu peak tốt và thời gian phân tích ngắn.
Sau khi tìm được tốc độ dịng tối ưu cho quá trình phân tách sắc ký, tỉ lệ dung môi pha động đã được khảo sát và tối ưu cho q trình phân tích. Kết quả thu được như sau:
Hình 3. 2: Sắc ký đồ của 7 chất chuẩn paraben với hai hệ dung môi khác nhau. Kết quả cho thấy, với cả hai hệ dung môi các paraben tách tốt ra khỏi nhau Kết quả cho thấy, với cả hai hệ dung môi các paraben tách tốt ra khỏi nhau và có thể áp dụng phân tích đồng thời. Từ đó, chọn hệ dung môi I: : (A): AcOH 0,05% trong MeOH, (B): MeOH để làm hệ dung môi chuẩn nhằm xác định đồng thời 7 paraben vì hệ dung mơi này khá đơn giản, dễ chuẩn bị và an toàn với người sử dụng.
Cuối cùng, các điều kiện của thiết bị đã tìm được thơng số tối ưu nhằm phân tích nhóm hợp chất paraben như sau:
Bảng 3. 1. Bảng thông số đã được tối ưu của thiết bị LC-MS/MS Sắc ký lỏng (LC): Sắc ký lỏng (LC): Thông số Giá trị Tốc độ dòng 0.3 mL/min Thể tích bơm mẫu 10 L Nhiệt độ buồng cột 40C
Dung môi (A): AcOH 0.05%
(B): MeOH
Khối phổ (MS/MS):
Ion mode Negative
Sheath gas 45 Abr.
Axiliary gas 12 Abr
Sweep gas 2.0 Abr
Ion tube temp. 320C
Source temp. 300C
Áp dụng các thông số của máy sau khi đã khảo sát để tiến hành phân tích các chất chuẩn paraben thu được kết quả sắc ký đồ như sau:
Hình 3. 3: Sắc ký đồ với nồng độ chất chuẩn paraben là 100 µg/L
Từ sắc ký đồ của chất chuẩn paraben ta có thời gian lưu của từng paraben như sau
Bảng 3. 2. Thời gian lưu của paraben
Paraben Thời gian lưu (phút)
MeP 6,54 EtP 7,30 n-PrP 8,15 Iso-PrP 8,42 BuP 9,89 BzP 9,78 HepP 15,27
Từ bảng trên và sắc ký đồ cho thấy với điều kiện phân tích sắc ký đã lựa chọn thì các paraben trong hỗn hợp đã tách riêng ra khỏi nhau khá tốt. Từ đó, có thể phân tích đồng thời các paraben trong cùng một hỗn hợp.
Tiến hành pha dãy chất chuẩn có nồng độ giảm dần để xác định giới hạn phát hiện của thiết bị (IDL: Instrumental detection limit) là lượng chất nhỏ nhất đưa vào máy mà detector có thể đo được và cho tín hiệu của peak cao gấp 3 lần đường nền. IDL cho phép đánh giá thiết bị hoạt động có ổn định khơng, nó bao gồm các loại nhiễu từ linh kiện cơ – điện tử của thiết bị, điều kiện vận hành máy và điều kiện môi trường xung quanh thường được ước lượng qua các dung dịch chuẩn. IDL được xác định bằng thực nghiệm và từ đó xác định giới hạn định lượng của thiết bị (IQL: Instrumental Quantification Limit) với cơng thức: IQL = 3×IDL. Đối với hệ thống LC-MS/MS trong báo cáo này IDL và IQL được tính cho mỗi paraben với thể tích bơm mẫu vào là 10 µL như sau
Bảng 3. 3. IDL và IQL của paraben
Paraben Thể tích dung dịch mẫu bơm vào máy IDL (pg) IQL (pg) MeP 10 µL 1,00 3,00 EtP 10 µL 1,00 3,00 n-PrP 10 µL 5,00 15,00 Iso-PrP 10 µL 5,00 15,00
BuP 10 µL 5,00 15,00
BzP 10 µL 1,00 3,00
HepP 10 µL 1,00 3,00
Các sắc ký đồ từng chất tại giới hạn phát hiện của thiết bị (IDL) được đưa ra ở phần phụ lục.
3.1.2. Quy trình xử lý mẫu
Tiến hành thí nghiệm bằng cách thay đổi tỉ lệ methanol, nước làm dung môi chiết (thay đổi với 3 tỉ lệ nước:methanol là 1:1; 2:5 và 1:5 về thể tích) và giữ nguyên các điều kiện còn lại. Thực hiện trên mẫu trắng (Na2SO4) thu được kết quả độ thu hồi bảy chất chuẩn paraben và hai chất đồng hành với mỗi tỉ lệ dung môi chiết như sau:
Bảng 3. 4. Độ thu hồi paraben khi sử dụng tỉ lệ dung môi chiết khác nhau
Paraben Độ thu hồi (%) sử dụng hỗn hợp dung môi H2O:Me
1:1 2:5 1:5 MeP 61,2 118,4 73,8 13C-MeP 61,0 117,8 73,2 EtP 54,6 85,2 60,4 n-PrP 56,8 103,5 65,6 Iso-PrP 46,0 84,7 57,1 BuP 50,7 92,2 62,2 13C-BuP 49,8 91,5 62,7 BzP 34,6 84,1 58,6 HepP 59,4 86,9 61,8
Kết quả thu được cho thấy độ thu hồi paraben trung bình khi sử dụng hệ dung môi H2O:Me 1:1 về thể tích nằm trong khoảng từ 34,6 – 61,2%. Bên cạnh đó, khi sử dụng hỗn hợp dung mơi với tỉ lệ H2O:Me 1:5 về thể tích thì độ thu hồi trung bình của các paraben thu được cao hơn (57,1 – 73,8%). Tuy nhiên, hỗn hợp dung môi tối ưu mà bảng kết quả cho thấy đó là hỗn hợp H2O:Me 2:5, khi sử dụng hỗn hợp dung môi này độ thu hồi tốt (84,1 – 118,4%) và chấp nhận để áp dụng vào
phương pháp phân tích. Từ đó, hỗn hợp dung mơi dùng để chiết chất phân tích ra khỏi mẫu bụi là H2O:Me 2:5 về thể tích.
Sau khi lựa chọn được tỉ lê hỗn hợp dung môi chiết và áp dụng với tỉ lệ đó và thay đổi thể tích dung dịch methanol dùng để rửa rải paraben ra khỏi cột chiết pha rắn. Thể tích methanol được dùng để khảo sát lần lượt là 5, 10 và 15 mL. Kết quả cũng được đánh giá qua độ thu hồi của chất phân tích trên nền mẫu trắng (Na2SO4)