2.2.2.1. Tách ADN tổng số từ máu
ADN tổng số đƣợc tách từ các mẫu máu theo phƣơng pháp đƣợc mô tả bởi Sambrook và cộng sự [45] với một số cải tiến cho phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm. Các bƣớc tiến hành nhƣ sau:
1. Mẫu máu đƣợc lấy ra khỏi tủ -200C, để tan trong điều kiện thƣờng, hút bỏ dịch huyết thanh bên trên sau đó đảo trộn kỹ lƣợng máu còn lại.
2. Thu tế bào: Thêm vào ống eppendorf (1,5ml) 0,7ml máu, bổ sung 0,7 ml
PBS 1X. Đảo trộn đều. Ly tâm 6000 v/p trong 15 phút ở nhiệt độ phòng (240C). Hút bỏ dịch pha trên, chỉ giữ lại phần cặn tế bào dƣới đáy ống. Lặp lại bƣớc này 3 lần.
3. Phá màng tế bào: Bổ sung 0,6 ml dung dịch Lysis và 6µl proteinase K, đảo
đều. Ủ trong ~3h ở 560
C bằng bể ổn nhiệt, cho đến khi mẫu tan hết cặn.
4. Loại protein: Bổ sung 0,6 ml phenol, vortex. Ly tâm 12000 v/p trong 15
phút ở 40
C. Thu dịch pha trên. Lặp lại với phenol – chloroform – isoamyl alcohol và chloroform – isoamyl alcohol. Lúc này dịch thu đƣợc chủ yếu còn lại là ADN.
5. Tủa ADN: Bổ sung NaCH3COO với tỷ lệ 1 NaCH3COO : 10 mẫu và ethanol 100% tỷ lệ 1 mẫu : 2 ethanol, đảo trộn đều. Ủ qua đêm trong tủ -200C. Ly tâm 12000 v/p trong 5 phút ở 40C. Loại dịch pha trên, thu ADN kết tủa dƣới đáy ống.
6. Rửa tủa: Bổ sung 0,5 ml ethanol 70%, búng đều lên cả thành ống, ly tâm
12000 v/p trong 5 phút ở 40C. Loại dịch, thu cặn. Lặp lại với 0,2 ml ethanol 70%. Để tủa khơ hồn tồn ở nhiệt độ phịng.
7. Hòa tan tủa: Bổ sung 50 µl đệm TE, búng đều để tủa tan hoàn toàn. Lấy
10µl mẫu, pha lỗng 10 lần bằng nƣớc khử ion vơ trùng.
8. Loại ARN: Bổ sung 2 µl RNase, ủ ở 370C trong vịng 1h30 phút. Bất hoạt enzym ở 900C trong vòng 30 phút. Bảo quản mẫu trong tủ -200
C.