M: marker 100bp ĐC: đối chứng 8T1-8T9, 8T31-8T36: sự phân tách sợi đơn từ các mẫu
3.4.1. Kết quả xử lý exon 16 bằng enzym Msp
Theo nghiên cứu của Nakamura và cộng sự (1998), khi sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP để phát hiện đột biến trên gen MLH1 gây ung thƣ ruột kết khơng polyp di truyền ở gia đình ngƣời Nhật Bản, đã phát hiện đƣợc 1 đột biến nhầm nghĩa tại bộ ba mã hóa 582 ở exon 16 của gen MLH1 (CTC GTC làm biến đổi axit amin Leuxin Valin). Nhóm nghiên cứu này đã tiến hành nghiên cứu 20 ngƣời trong số
148 ngƣời của 1 gia đình mắc hội chứng ung thƣ ruột kết khơng polyp di truyền lớn nhất ở Nhật Bản và phát hiện đƣợc 6 trong số 20 ngƣời này mang đột biến nhầm nghĩa ở bộ ba mã hóa 582 của exon 16 (30%). Trong thí nghiệm, Nakamura và cộng sự đã sử dụng enzym MspI để tiến hành phản ứng cắt với sản phẩm PCR (kích
thƣớc ≈136 bp) đƣợc khuếch đại bởi cặp mồi PM171 và PM173. Enzym MspI có trình tự nhận biết CCGG và cắt ở vị trí nucleotit thứ 2 (C/CGG). Nếu khơng có đột biến thì sản phẩm PCR sẽ bị cắt thành 2 đoạn với kích thƣớc 116 bp và 20 bp. Khi xuất hiện đột biến nhầm nghĩa ở bazơ đầu tiên của codon 582 (CTCGTC), trình tự sản phẩm PCR sẽ xuất hiện thêm 1 vị trí nhận biết của enzym MspI và bị cắt
thành 3 đoạn với kích thƣớc 34 bp, 82 bp và 20 bp. Kết quả thí nghiệm của Nakamura và cộng sự đƣợc thể hiện ở Hình 28.
Hình 28. Kết quả PCR-RFLP các mẫu máu từ 20 thành viên của gia đình mắc hội chứng
ung thƣ ruột kết khơng polyp di truyền ở Nhật Bản (điện di trên gel agarose 6% và nhuộm bằng ethidium bromide). M: marker, C: đối chứng (ngƣời không mắc bệnh), 2-37: các mẫu
Trong điều kiện phịng thí nghiệm và điều kiện thu thập mẫu bệnh phẩm, chúng tôi tiến hành phản ứng cắt bằng enzym giới hạn đối với 50 mẫu ADN từ các bệnh nhân khác nhau về tuổi tác, giới tính, gia đình... nhằm phát hiện đột biến này. Sản phẩm PCR chúng tơi khuếch đại có kích thƣớc khoảng 280 bp. Nếu khơng có đột biến xảy ra thì trên trình tự ADN của sản phẩm PCR có một vị trí nhận biết của enzym MspI và sản phẩm PCR sẽ bị cắt thành 2 đoạn có kích thƣớc khoảng 270 bp và 10 bp. Nếu có đột biến ở bộ ba mã hóa 582 (CTCGTC) thì trên trình tự ADN của sản phẩm PCR sẽ xuất hiện thêm 1 vị trí cắt của enzym MspI và sản phẩm PCR sẽ bị cắt thành 3 đoạn với kích thƣớc 10 bp, 56 bp và 214 bp. Kết quả dự đoán khi điện di sản phẩm cắt bằng enzym giới hạn đƣợc trình bày ở Hình 29.
Hình 29. Dự đoán kết quả phản ứng cắt exon 16 gen MLH1 bằng enzym MspI
Kiểu gen đồng hợp tử C/C sẽ cho 2 băng với kích thƣớc lần lƣợt là 270 và 10 bp. Kiểu gen dị hợp tử C/G sẽ cho 4 băng với kích thƣớc lần lƣợt là 270, 214, 56 và 10 bp. Kiều gen đồng hợp tử G/G sẽ cho 3 băng với kích thƣớc lần lƣợt là 214, 56 và 10 bp.
Sau khi tiến hành phản ứng cắt các sản phẩm PCR của exon 16 gen MLH1
theo quy trình đã đƣợc trình bày ở chƣơng 2, sản phẩm cắt đƣợc điện di trên gel agarose 2% cùng với marker 100 bp và sản phẩm PCR của exon 16 gen MLH1. Kết quả điện di thể hiện trên Hình 30.
Hình 30. Sản phẩm cắt exon 16 và sản phẩm PCR exon 16 điện di trên gel agarose 2%
ở 60V. M: marker 100 bp. Giếng 1-2: sản phẩm PCR exon 16. Giếng 3-5: sản phẩm cắt exon 16 bằng enzym MspI.
Phân tích ảnh điện di ta thấy, với các giếng sản phẩm PCR các băng lên sáng rõ hơn hẳn so với các giếng tra sản phẩm cắt. Mặc dù kích thƣớc chênh lệch khơng đáng kể, nhƣng vẫn có sự khác biệt. Do đó, q trình cắt đã diễn ra hồn tồn, sản phẩm cắt của chúng tôi thu đƣợc đều cho 2 băng với kích thƣớc 270 và 10 bp, tuy nhiên vì kích thƣớc băng 10 bp quá nhỏ khó quan sát trên độ phân giải của gel agarose 2% nên chỉ nhìn thấy băng có kích thƣớc 270 bp. Từ kết quả thu đƣợc cho thấy trong 50 mẫu chúng tơi nghiên cứu khơng có mẫu nào mang gen đột biến ở vị trí bộ ba mã hóa 582 của exon 16 gen MLH1. Tất cả các mẫu đều mang kiểu gen đồng hợp về alen kiểu dại C/C.