Hình 3.8. Giới hạn phát hiện A: phản ứng PCR, B: phản ứng LAMP.
M(A): thang DNA chuẩn 1kb, M(B): thang DNA chuẩn 1kb, (-): đối chứng âm.
Như vậy bằng phương pháp LAMP với các cặp mồi được thiết kế đặc hiệu cho gen eae, chúng tôi đã phát hiện thành công gen eae ở nồng độ rất thấp là 1,5
pg/µl. Kết quả này tương đồng với một số nghiên cứu đã công bố của các tác giả khác khi sử dụng phương pháp LAMP để phát hiện các gen đích. Kuboki (2003) khi nghiên cứu đơn bào trypanosome gây bệnh ngủ ở người và gia súc sử dụng phương pháp LAMP phát hiện thành công T. brucei PFR A ở giới hạn nồng độ 1 pg tổng DNA, trong khi giới hạn phát hiện bằng PCR là 100 pg [29]. Cũng dùng phương pháp LAMP để phát hiện nấm Fusarium Nessie công bố phát hiện được gen đích
gaoA - gen mã hóa galactose oxidase ở nồng độ 2 pg [30]. Verma (2017) phát hiện Leishmania tropica ở nồng độ 1pg [56]. Năm 2010, tác giả Trần Thị Thanh Huyền
đã dùng phương pháp LAMP để phát hiện thành công vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh Gan thận mủ trên cá Tra việt Nam, ở nồng độ 9,4 fg [8]. Engku (2017) phát hiện
Vibrio cholerae ở nồng độ 10fg [16], thấp hơn gần 100 lần so với nghiên cứu của
chúng tôi.
Như vậy, từ nghiên cứu của chúng tôi và các công bố của các tác giả khác nhau cùng sử dụng kỹ thuật LAMP để phát hiện gen đích cho thấy, đây là phương pháp có độ nhạy cao với giới hạn phát hiện ở mức rất thấp, phương pháp này cho độ nhạy cao gấp từ 10 – 100 lần so với các phương pháp PCR thông thường khi cùng phát hiện một gen đích. Do vậy, phương pháp LAMP có thể được sử dụng để phát hiện giai đoạn sớm của bệnh, góp phần trong cơng tác phịng chống và điều trị bệnh tích cực cho bệnh nhân.
3.4.3. Kết quả phát hiện gen eae của phản ứng LAMP sử dụng chỉ thị màu
Sản phẩm của phản ứng LAMP tạo ra khối lượng DNA mạch đôi rất lớn đồng thời tạo ra nhiều sản phẩm phụ. Do đó, với mục đích phát hiện sản phẩm của phản ứng LAMP bằng mắt thường mà không cần phải điện di trên gel agarose, các thuốc nhuộm DNA mạch đôi như SYBR Green I hoặc chỉ thị kim loại như Calcein được thêm vào các ống phản ứng để nhận biết sự thay đổi màu sắc.
*Kết quả phát hiện gen eae của phản ứng LAMP sử dụng chỉ thị Calcein:
Trong quá trình tiến hành phản ứng LAMP, mỗi ống phản ứng được bổ sung 1 µl Calcein, sau đó chạy phản ứng LAMP theo chu trình đã trình bày ở chương 2.
Kết quả phản ứng được quan sát dưới ánh sáng thường (Hình 3.9) hoặc soi dưới đèn UV (Hình 3.10)
Hình 3.9. Phát hiện sản phẩm LAMP bằng chỉ thị màu Calcein.
(-): mẫu đối chứng âm, nồng độ DNA giảm từ 15ng đến 15fg.
(-) (+)
Hình 3.10. Phát hiện sản phẩm LAMP bằng chỉ thị Calcein dưới ánh sáng UV. (-): phản ứng âm tính, (+): phản ứng dương tính. (-): phản ứng âm tính, (+): phản ứng dương tính.
Như vậy, khi thêm calcein vào các ống phản ứng, dưới ánh sáng thường những mẫu dương tính dung dịch sau phản ứng sẽ phát quang và chuyển sang màu xanh lá cây, những mẫu âm tính dung dịch sau phản ứng khơng phát quang và vẫn có màu vàng cam. Dưới ánh sáng UV, những mẫu dương tính dung dịch sau phản ứng có màu xanh lá cây rất sáng, mẫu âm tính khơng phát sáng và có màu đen. Kết quả thay đổi màu sắc thấy dõ ở các nồng độ nồng độ DNA pha loãng giảm dần tử 15 ng đến 1,5 pg. Kết quả này hoàn toàn trùng khớp với kết quả phát hiện sản phẩm LAMP bằng điện di trên gel agarose 2% (Hình 3.9B).
SYBR Green I có khả năng bắt cặp với các DNA sợi đôi, việc tồn tại DNA được khuếch đại sẽ làm cho SYBR Green I chuyển từ màu vàng cam sang màu xanh. Do nồng độ DNA sau khi được khuếch đại bằng phương pháp LAMP cao hơn nhiều lần so với các phương pháp khuếch đại thông thường khác như PCR nên dấu hiệu chuyển màu rất rõ ràng. Do đó, sản phẩm của phản ứng LAMP có thể được nhận biết bằng mắt thường nhờ chỉ thị SYBR Green I, mỗi ống phản ứng được bổ sung thêm 2 µl SYBR Green I sau khi phản ứng LAMP kết thúc. Kết quả sự thay đổi màu sắc của sản phẩm phản ứng được biểu diễn trên Hình 3.11.
Hình 3.11. Phát hiện sản phẩm LAMP bằng chỉ thị màu SYBR Green I.
(-): mẫu đối chứng âm, nồng độ DNA giảm từ 15 ng đến 15fg.
Các ống có nồng độ từ 15 ng đến 1,5 pg có kết quả dương tính, phát quang màu xanh, các ống cịn lại khơng phát quang màu xanh cho kết quả âm tính. Như vậy, giới hạn phát hiện phản ứng LAMP bằng SYBR Green I hoàn toàn giống với kết quả điện di trên gel agarose 2% hay sử dụng chỉ thị Calcein. Tuy nhiên, do SYBR Green I được bổ sung sau khi phản ứng kết thúc nên với hàm lượng DNA lớn được khuếch đại sau phản ứng nên việc lây nhiễm là điều có thể xảy ra với bất cứ phịng thí nghiệm nào. Do đó, để tránh việc lây nhiễm và thuận lợi trong việc ứng dụng ngồi thực tế, có giá trị về mặt kinh tế thì Calcein đáp ứng được các tiêu trí trên hơn là SYBR Green I.
3.5. Xây dựng sơ đồ phát hiện vi khuẩn E. coli mang gen eae gây tiêu chảy
bằng kĩ thuật LAMP
Qua các bước nghiên cứu ở trên, có thể thấy LAMP là một kĩ thuật sinh học phân tử cho kết quả nhanh, chính xác và đặc hiệu rất phù hợp trong các xét nghiệm
chẩn đoán vi sinh vật gây bệnh. Mặc dù đây khơng phải một cơng cụ tồn diện có thể thay thế các kĩ thuật khác nhưng kĩ thuật LAMP cung cấp thêm một công cụ hữu hiệu trong việc phịng ngừa, sàng lọc và chẩn đốn các bệnh nhiễm khuẩn cho bệnh nhân và hồn tồn có thể áp dụng tại các tuyến cơ sở. Do vậy, chúng tôi bước đầu xây dựng sơ đồ phát hiện gen eae của vi khuẩn E. coli bằng kĩ thuật LAMP trong phòng xét nghiệm, với các bước tiến hành như sau (Hình 3.12):
Hình 3.12. Sơ đồ các bước tiến hành chẩn đoán vi khuẩn E. coli bằng kĩ thuật Lamp.
+ Bước 1. Thu nhận mẫu bệnh phẩm phân của bệnh nhân tiêu chảy kèm theo phiếu yêu cầu xét nghiệm: Mẫu bệnh phẩm phải lấy đủ số lượng 1-2ml, được vận chuyển và bảo quản đúng cách. Trên hộp đựng mẫu có ghi đầy đủ thơng tin người bệnh, tên người lấy mẫu và thời gian lấy mẫu.
Khuếch đại LAMP Mẫu bệnh phẩm
Nuôi cấy khuẩn lạc
Tách DNA tổng số
+ Bước 2. Nuôi cấy phân lập: bệnh phẩm phân được ria cấy trên môi trường chọn lọc DCL, ủ ấm ở 37oC, trong thời gian 18-24 giờ.
+ Bước 3. Tách DNA tổng số: chọn 5-7 khuẩn lạc nghi ngờ là vi khuẩn E.
coli được tách DNA bằng phương pháp thuận tiện nhất có trong cơ sỏ xét nghiệm.
+ Bước 4. Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng: Hỗn hợp phản ứng được chuẩn bị trên đá lạnh và phải đảm bảo không bị nhiễm DNA từ mơi trường bên ngồi vào.
Bst polymease được bảo quản ở -20oC và chỉ lấy ra khi đã trộn xong các thành phần phản ứng khác.
+ Bước 5. Bổ sung DNA vào ống phản ứng: hỗn hợp phản ứng được chia ra nhiều ống khác nhau với thể tích mong muốn, sau đó bổ sung mỗi ống phản ứng 1 µl DNA khn.
+ Bước 6. Khuếch đại DNA: các ống phản ứng được ủ ở thiết bị ổn nhiệt ở nhiệt độ 64oC trong vòng 60 phút.
+ Bước 7. Nhận biết kết quả: Kết quả phản ứng được nhận biết bằng màu sắc của dung dịch sau phản ứng. Những mẫu dương tính sẽ phát quang màu xanh lá cây, mẫu âm tính có màu vàng cam.
KẾT LUẬN
1. Đã phân lập và xác định được các đặc điểm hóa sinh điển hình của 25 chủng vi khuẩn E. coli từ các mẫu phân của bệnh nhân tiêu chảy tại Bệnh viện
Trung ương Thái Nguyên. Tỷ lệ vi khuẩn E. coli mang gen độc eae là 13/25 chiếm 54%.
2. Đã ứng dụng thành công phương pháp LAMP để xác định gen độc lực gây bệnh eae của vi khuẩn E. coli.
3. Đã thiết kế được cặp mồi đặc hiệu nhân gen eae đặc trưng của vi khuẩn E. coli gây tiêu chảy phân lập tại Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên bằng kĩ thuật
LAMP. Đồng thời đã ứng dụng thành công việc phát hiện sản phẩm của phản ứng LAMP bằng mắt thường bằng chỉ thị kim loại Calcein và chỉ thị SYBR Green I. Bộ mồi LAMP khuếch đại gen eae là hoàn toàn đặc hiệu cho với giới hạn phát hiện là 1.5 pg, cao gấp hơn 100 lần so với phương pháp PCR với độ đặc hiệu cạo
4. Đã xây dựng được sơ đồ phát hiện vi khuẩn E. coli mang gen eae gây tiêu chảy bằng kĩ thuật LAMP ở phịng thí nghiệm.
KIẾN NGHỊ
1. Tiếp tục hoàn thiện phương pháp LAMP để xác định các gen độc lực khác gây bệnh tiêu chảy của vi khuẩn E. coli và nghiên cứu với số mẫu lớn hơn để đánh giá được tỷ lệ các loại vi khuẩn E. coli gây tiêu chảy trên bệnh nhân.
2. Tối ưu hóa phản ứng LAMP để phát hiện vi khuẩn E. coli gây tiêu chảy
cũng như các tác nhân gây bệnh khác và ứng dụng kĩ thuật LAMP tại các cơ sở khám chữa bệnh tại tỉnh Thái Nguyên.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
1. Bộ Y tế (2009), Tài liệu hướng dẫn xử trí tiêu chảy ở trẻ em, Ban hành kèm
theo quyết định số 4121/QĐ-BYT ngày 28/10/2009, Hà Nội. 2. Bộ Y tế (2013), Vi sinh vật y học, NXB Y học, tr. 172-174.
3. Hồng Thị Bích Ngọc (2017), Xác định sự phân bố và một số đặc điểm sinh học
phân tử của nhóm Escherichia coli gây tiêu chảy ở trẻ em dưới 5 tuổi tại địa bàn Hà Nội, Luận án tiến sỹ Y học, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, Hà
Nội.
4. Nguyễn Thanh Thảo, Lê Thị Tài, Nguyễn Văn Hiến, Lê Thị Hoàn, Nguyễn Hồng Long, Lê Thị Thanh Xn (2014), “Tình hình bệnh tiêu chảy tại Việt Nam giai đoạn 2002 – 2011”, Tạp chí Y học dự phịng, 24(7), tr. 156
5. Nguyễn Vũ Trung, Lê Huy Chính, Lê Văn Phủng, Andrej Weintraub (2003), “Phát triển và ứng dụng kỹ thuật PCR đa mồi trong chẩn đoán E. coli gây
tiêu chảy từ phân”. Tạp chí Nghiên cứu Y học. tr. 7-14.
6. Nguyễn Yến Bình (2003), Nghiên cứu một số vi sinh vật gây tiêu chảy cấp ở trẻ
từ 3 tháng đến 5 tuổi tại bệnh viên Xanh Pơn- Hà nội và tính kháng thuốc của chúng, Luận văn Bác sỹ chuyên khoa 2, Trường Đại học Y Hà Nội, Hà
Nội.
7. Phùng Đắc Cam (2009), Bệnh tiêu chảy, Nxb Y học, tr. 110-122.
8. Trần Thị Thanh Huyền (2010), Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật LAMP (Loop - mediated isothermal amplification) để xác định vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Đại học
TIẾNG ANH
9. Bii C.C, Taguchi H., Ouko T.T, Muita W., Wamae N., Kamiya S. (2005), “Detection of virulencerelated genes by Multiplex PCR in multidrug- resistant diarrhoeagenic Escherichia coli isolates from Kenya and Japan”, Epidemiol Infect, 133(4), pp.627-633.
10. Bista BR, Ishwad C, Wadowsky RM, Manna P, Randhawa PS, Gupta G, Adhikari M, Tyagi R, Gasper G, Vats A (2007), “Development of a Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay for Rapid Detection of BK Virus”, J Clin Microbiol, 45 (5), pp.1581-1587.
11. Bui T.H, Flemming S., Phung D.C, Oralak S., Tran T.H, Tran M.T, Anders D (2008), “Diarrheagenic Escherichia coli and Shigella Strains Isolated from
Children in a Hospital Case-Control Study in Hanoi, Vietnam”, Journal of
Clinical Microbiology, 46(3), pp.996-1004.
12. Teh C S J,Chua K H,Lim Y,Lee S C, ThongK L(2014), “Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay for Detection of Generic and Verocytotoxin-Producing Escherichia coli among Indigenous Individuals in Malaysia”, The Scientific World Journal ,pp.6.
13. D J Evans, Jr , D G Evans (1977), “Direct serological assay for the heat-labile enterotoxin of Escherichia coli, using passive immune hemolysis”, Inun Immun, 16 (2), pp.604-609.
14. Rasko DA1, Webster DR, Sahl JW, Bashir A, Boisen N, Scheutz F, Paxinos EE, Sebra R, Chin CS, Iliopoulos D, Klammer A, Peluso P, Lee L, Kislyuk AO, Bullard J, Kasarskis A, Wang S, Eid J, Rank D, Redman JC, Steyert SR, Frimodt-Moller J, Struve C, Petersen AM, Krogfelt KA, Nataro JP, Schadt EE, Waldor MK, (2011), “Origins of the E. coli Strain Causing an Outbreak of Hemolytic–Uremic Syndrome in Germany”, N Engl J Med,
365, pp.709-71
15. Davidson G, Barnes G, Bass D, Cohen M , Fasano A, Fontaine O , Guandalini S. (2002), “Infectious diarrhea in children: working group report of the First
World Congress of Pediatric Gastroenterology, Hepatology, and Nutrition”. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr, 35(2), pp.143-150.
16. Engku Nur Syafirah EAR, Nurul Najian AB, Foo PC, Mohd Ali MR, Mohamed M, Yean CY(2018), “An ambient temperature stable and ready-to-use loop-mediated isothermal amplification assay for detection of toxigenic Vibrio cholerae in outbreak settings” Acta Trop;182:223-231 17. Fei Wang, Qianru Yang, Yinzhi Qu, Jianghong Meng, Beilei Ge(2014),
“Evaluation of a Loop-Mediated Isothermal Amplification Suite for the Rapid, Reliable, and Robust Detection of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli in Produce”, Appl Environ Microbiol, 80(8), pp.2516-2525.
18. Fratamico P.M., Bagi L.K. (2012), “Detection of Shiga toxin- producing Escherichia coli in ground beef using the GeneDisc real-time PCR system”, Front Cell Infect Microbio,l 2,pp. 152
19. Gomes T A T, Rassi V, Macdonald K L, Ramos S R T S, Trabulsi L R, Vieira M A M, Guth B E C, Candeias J A N, Ivey C, Toledo M R F, Blake P A(1991), “Enteropathogens associated with acute diarrheal disease in urban infants in Sao Paulo, Brazil”. J Infect Dis, 164, pp.331-337
20. Goto M, Honda E, Ogura A, Nomoto A, Hanaki K (2009), “Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue”, Biotechniques, 46(3), pp.167-72.
21. Hsu YH , Chou SJ , Chang CC , Pan MJ , Yang WC , Lin CF , Chan KW , (2017), “Development and validation of a new loop-mediated isothermal amplification for detection of pathogenic Leptospira species in clinical materials” J Microbiol Methods.,141, pp.55-59.
22. Jams PN, Jams BK(1998), “Diarrheagenic Escherichia coli”, Cnilical Microbioly Review; 11(1), pp.142-210.
23. Jenkins C., Lawson A. J., Cheasty T., Willshaw G. A. (2012), ”Assessment of a real-time PCR for the detection and characterization of verocytotoxigenic Escherichia coli”. J Med Microbiol 61, pp.1082–1085.
24. Li JJ, Xiong C, Liu Y, Liang JS, Zhou XW (2016), “Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP): Emergence As an Alternative Technology for Herbal Medicine Identification”, Front. Plant Sci, 7, pp.1956.
25. Joshua Hill, Shilpa Beriwal, Ishwad Chandra, Vinod K. Paul,Aarti Kapil, Tripti Singh, Robert M. Wadowsky, Vinita Singh, Ankur Goyal, Timo Jahnukainen, James R. Johnson, Phillip I. Tarr, Abhay Vats (2008), “Loop- Mediated Isothermal Amplification Assay for Rapid Detection of Common Strains of Escherichia coli”, J Clin Microbiol. 46(8), pp 2800-2804.
26. Karlsen F., Steen H.B., and Nesland J.M. (1995), “SYBR green I DNA staining increases the detection sensitivity of viruses by polymerase chain reaction”,
J Virol Methods, 55 (1), pp.153-156.
27. Kim A. Piera, Ammar Aziz, Timothy William, David Bell, Iveth J. González, Bridget E. Barber, Nicholas M. Anstey, Matthew J. Grigg (2017), “Detection of Plasmodium knowlesi, Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax using loop-mediated isothermal amplification (LAMP) in a co-endemic area in Malaysia” Malaria Journal, pp.16-29.
28. Konaté A, Dembélé R, Kagambèga A, Soulama I, Kaboré WAD, Sampo E, Cissé H, Sanou A, Serme S, Zongo S, Zongo C, Fody AM, Guessennd NK 5 , Traoré AS, Gassama-Sow A, Barro N, (2017), “Molecular Characterization of Diarrheagenic Escherichia Coli in Children Less Than 5 Years of Age with Diarrhea in Ouagadougou, Burkina Faso” Eur J Microbiol Immunol, 7(3), pp.220-228.
29. Kuboki N., Inoue N., Sakurai T., Di Cello F., Grab D.J., Suzuki, and H. S., C., Igarashi I, (2003), “Loop-mediated isothermal amplification for detection of African trypanosomes”, J. Clin.Microbiology, 41, pp. 5517-5524.