Calcein có cơng thức hóa học C30H26N2O13, có màu trắng hoặc màu vàng cam dạng bột. Calcein tạo thành một hợp chất phát huỳnh quang mạnh phát ra ánh sáng màu xanh huỳnh quang khi kết hợp với các kim loại kiềm thổ. Sự phát huỳnh quang của Calcein bị dập tắt bởi các ion kim loại như Co2+
, Ni2+, Cu 2 +, Fe3+ và Mn2+. Khi bổ sung Calcein vào phản ứng LAMP, ban đầu do sự có mặt của ion Mn2+, Calcein liên kết với Mn2+ khơng phát quang, dung dịch có màu da cam. Khi phản ứng
dương tính, bên cạnh sự khuếch đại DNA xảy ra thì đồng thời phẩm phụ là ion P2O74- được tạo thành sẽ kết hợp với ion Mg2+
tạo thành muối Mg2P2O7, sau đó ion Mn2+ đẩy Mg2+ khỏi muối để tạo thành muối Mn2P2O7 và giải phóng ion Mg2+ tự do trong dung dịch sẽ kết hợp với Calcein tạo ra phức hợp Calcein-Mg phát quang.
Hình 1.7. Phát hiện phản ứng LAMP bằng đo độ đục,
bằng huỳnh quang hoặc soi dưới đèn UV [8].
Mg2+ SYBR - G PicoRed HNB - + - + - + - +
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu
- 25 mẫu phân của bệnh nhân tiêu chảy tại Khoa Vi sinh, Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên dùng cho nghiên cứu phân lập vi khuẩn E. coli.
- Các chủng vi khuẩn YTN1, YTN2, là các vi khuẩn E. coli không gây bệnh, được cung cấp bởi Bộ môn Vi sinh - Trường Đại học Y Dược Thái Nguyên.
- Chủng vi khuẩn S. aureus được cung cấp tại Khoa Xét nghiệm Vi sinh -
Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên.
* Mồi nhân gen:
Bảng 2.1 Danh sách các mồi nhân gen eae của vi khuẩn E. coli bằng kỹ thuật LAMP và PCR và mồi nhân gen 16S.
Bảng 2.1 Danh sách các cặp mồi trong nghiên cứu.
Mồi Chiều dài Trình tự (5’-3’)
PCR SK1 24 CCCGAATTCGGCACAAGCATAAGC SK1 25 CCCGGATCCGTCTCGCCAGTATTCG LAMP F3 19 CGACGATTTGGTCGTTGAA B3 18 TGTCATCGGTCATGTTGC FIP 51 CAAAATGATCTGCTGACCAGGCTTTTTAAGCATTTA TACAGTTCTGAAAGC BIP 52 ACAGTGCACTACCACTTTTAGGTTTTTCATTTTAGTC AGTTTATTCGTGTGA PCR 16S fD1 20 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG rD1 20 ACGTTACCTTGTTACGACTT
2.1.2. Hóa chất và thiết bị thí nghiệm
2.1.2.1. Các loại hóa chất:
SYBR Green I, Betain, Calcein, pepton, cao thịt, agar, phenol, chloroform, iso-amylalcohol, glycerol, ethanol, MgSO4, MnCl2, NaCl, HCl, NaCH3COO, axit acetic, lactose, sodium chloride, sodium citrate, sodium deoxycholate, Neutral red,
nước cất, nước khử ion, bộ kit dùng tinh sạch ADN (Qiagen, Đức), kit API 20E (Biomerieux)....
2.1.2.2. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu
* Môi trường thạch thường:
Thành phần Khối lƣợng (g/l) Pepton 10 NaCl 5 Cao thịt 4 Thạch 20 Nước cất 1000ml
- Cách pha môi trường: Đun sơi hồ tan hồn tồn các thành phần, điều
chỉnh pH 7,4-7,6. Đóng ống 16mm mỗi ống 6ml. Hấp 121oC/15 phút. Để nghiêng ống thạch cho thạch đông. Nếu đổ đĩa: Sau khi hấp, để nguội 45-50oC đổ 20ml/đĩa.
* Môi trường DCL (Deoxycholate Citrate Lactose)
Thành phần Khối lƣợng (g/l) Peptone 10 Lactose 10 Sodium chloride 5 Sodium citrate 2 Sodium deoxycholate 0.5 Neutral red 0.03 Agar 15 Nước cất 1000
Cách pha môi trường: Hịa tan hồn tồn 42,5 g trong 1000 ml nước cất vơ trùng, đun sơi và khuấy đều. Sau đó đổ ra đĩa vô trùng. Môi trường sẽ mất hiệu quả nếu bị q nóng vì vậy khơng hấp khử trùng và quay thạch lại. pH cuối cùng 7,1 ± 0,2.
* Môi trường thạch máu: Thành phần Khối lƣợng (g/l) Pepton 10 NaCl 5 Cao thịt 4 Agar 20 Nước cất 1000ml Máu thỏ 50ml
Cách pha môi trường: Đun sơi hồ tan hồn tồn các thành phần, điều chỉnh
pH 7,4-7,6. Hấp khử trùng 121oC/15 phút. Để nguội 45-50oC, cho 50ml máu vào quay trịn bình cho máu hòa tan đều trong thạch. Màu thạch đỏ tươi là đạt tiêu chuẩn, nếu môi trường màu ngả đen là máu đã chín. Để nguội 45-50oC đổ 20ml/đĩa.
2.1.2.3. Dung dịch và đệm
Trong quá trình nghiên cứu, đã sử dụng các loại dung dịch và đệm cơ bản sau:
Bảng 2.2. Thành phần các dung dịch và đệm Dung dịch Thành phần, nồng độ Dung dịch Thành phần, nồng độ Đệm TAE 242g Tris - Base 57,1 ml CH3COOH 100 ml 0,5 EDTA H2O vừa đủ 1000 ml pH = 8,5
Dung dịch nhuộm gel 0.1 µg/ml ethidium bromide
Loading dye
0,25 % bromophenol blue 40% sucrose
2.1.2.4. Thiết bị thí nghiệm
Bảng 2.3. Các thiết bị dùng trong nghiên cứu
Thiết bị Hãng sản xuất (nƣớc)
Bể điện di BIORAD, Mỹ Bể ổn nhiệt BIORAD, Mỹ Box cấy vô trùng ESCO, Singapore Buồng thao tác PCR ESCO, Singapore Cân điện tử Sartorious, Đức Hệ thống chụp ảnh điện di BioDoc-ItTM, Mỹ Kính hiển vi quang học Olympus, Trung Quốc. Lị vi sóng Sharp – Malaysia Máy ly tâm lạnh 5417 R Đức
Máy PCR BIORAD, Mỹ Máy ủ nhiệt lắc rung Eppendorf, Đức Máy voltex Anh
Nồi khử trùng ướt Tomy, Nhật Bản Pipet (pipet man, pipet Pastuer) Pháp
Thiết bị điện di BIORAD, Mỹ Tủ ấm, tủ sấy Memmert, Đức Tủ lạnh -20oC Frigor, Đan Mạch Tủ lạnh -80oC Frigor, Đan Mạch Máy nanodrop Thermo Fisher, Mỹ
2.2. Địa điểm nghiên cứu
- Phòng xét nghiệm Vi sinh - Sinh học phân tử, Bộ môn Vi sinh - Trường Đại học Y - Dược Thái Nguyên.
- Phịng thí nghiệm Vi sinh vật học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên – ĐHQG Hà Nội.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Sơ đồ nghiên cứu
Với mục tiêu sử dụng một phương pháp cho kết quả nhanh nhạy và đặc hiệu để chẩn đoán vi khuẩn E. coli gây tiêu chảy ở người, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu theo sơ đồ sau: