CHƢƠNG 2 : NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.2. Thực hiện phản ứng RT-PCR
Chain Reaction)
Kĩ thuật RT-PCR (phản ứng PCR ngược) là phản ứng nhân một đoạn khn RNA theo ngun lí của phản ứng PCR, bao gồm 2 giai đoạn:
- Tổng hợp đoạn cDNA (DNA bổ sung) từ sợi RNA làm khuôn nhờ enzym phiên mã ngược (enzym reverse transcriptase; còn gọi là giai đoạn chuyển ngược (RT-Reverse Transcription).
- Thực hiện phản ứng PCR từ khuôn cDNA sản phẩm của giai đoạn chuyển ngược theo chu kì nhiệt [2].
Bảng 2.1. Danh sách các mồi sử dụng trong thu nhận, lưu giữ và giải mã các gen NP, M, và
NS của virus cúm A/H5N1.
Tên mồi Trình tự chuỗi mồi (5’->3’) Mô tả
Thu nhận
gen
NPF ATGGCGTCTCAAGGCACC Mồi xuôi Gen
NP
NPR TTAATTGTCATACTCCTCTGC Mồi ngược
MAF ATGAGTCTTCTAACCGAGGTC Mồi xuôi Gen
M
MAR GAA ACA AGGTAGTTTTTTACTCC Mồi ngược
NSF1 AGCAAAAGCAGGGTGACAAAGACA Mồi xuôi Gen
NS
NSR1 AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTTAT Mồi ngược
Cách tiến hành phản ứng RT-PCR và thành phần như sau (bảng 2.2):
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng RT-PCR
Tên hóa chất Thể tích (µl)
Buffer 5X reaction mix (Qiagen Inc.) 10
dNTP mix (10mMol/µl) 2
Enzym mix 2
Mồi xi (10pMol/µl) 3
Mồi ngược 10pMol/µl) 3
Khn RNA tổng số 6
Nước tinh khiết 24
Tổng thể tích: 50
Sản phẩm RT-PCR được kiểm tra bằng điện di trên thạch agarose 1%, nếu có kích thước đúng như với tính tốn của cặp mồi thiết kế, sẽ tiến hành tinh sạch sản phẩm bằng bộ hoá chất QIAquick PCR Purification Kit và tiến hành dịng hố lưu giữ sản phẩm.
Chu trình nhiệt của phản ứng:
2.2.3. Kĩ thuật dịng hóa (cloning)
Dịng hố là gắn nối (ligation) một đoạn DNA ngoại lai (sản phẩm PCR/RT- PCR) vào trong hệ gene của một vòng DNA đã được thiết kế sẵn gọi là plasmid mang (vector dẫn truyền) tạo ra vector tái tổ hợp và chuyển nạp (transformation) vào tế bào chủ thích ứng (thường là tế bào E.coli thuần chủng) tạo dòng tái tổ hợp. Sau khi chuyển nạp tiến hành nuôi cấy để nhân lên với số lượng lớn các bản sao DNA ngoại lai (plasmid tái tổ hợp) và chọn lọc vi khuẩn tái tổ hợp theo hai cơ chế: cơ chế X-gal và cơ chế kháng sinh nhằm loại trừ những vi khuẩn không tái tổ hợp.
42OC - 59 phút 95OC - 10 phút 94OC - 1 phút 46OC - 1 phút 72OC - 2 phút 72OC - 10 phút 1 chu kỳ 40 chu kỳ 4OC
pCR®2.1-TOPO®
3931 nucleotides
Tách chiết các khuẩn lạc đơn dòng để thu được lượng DNA ngoại lai (DNA plasmid) được nối vào vector bằng phản ứng cắt với enzym giới hạn [2].
Chúng tôi sử dụng plasmid mang (còn gọi là vector dẫn truyền) pCR®2.1- TOPO® với bộ Kit TOPO-TA cloning (Invitrogen) (Hình 2.3). Đây là loại vector được thiết kế có đầu lồi T (Thymin) phù hợp gắn với các DNA có đầu lồi A (Adenin) sản phẩm của RT-PCR sử dụng enzym Taq-polymerase, theo nguyên tắc bổ sung tạo nên plasmid tái tổ hợp mang đoạn DNA ngoại lai. Sản phẩm sau phản ứng được chuyển nạp vào các tế bào khả biến E. coli DH5α-T1 (Invitrogen; và được ni cấy để chọn lọc các dịng tế bào tái tổ hợp để thu nhận nhiều đoạn DNA tái tổ hợp chính xác.
Hình 2.3. Sơ đồ cấu tạo vector pCR®2.1-TOPO® (Invitrogen).
Các bước như sau:
* Thực hiện phản ứng nối DNA ngoại lai - sản phẩm của RT-PCR (Bảng 2.3)
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng nối
Tên hóa chất Thể tích (µl)
10X Ligation Buffer 1 pCRđ2.1 Vector (25ng/àl) 1
Enzym T4-lygase 1
Nước tinh khiết (khử ion) 6 cDNA sản phẩm RT-PCR 1
* Chuyển nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến DH5α-T1
* Nuôi cấy chọn lọc tế bào tái tổ hợp: Trải đều mẫu tế bào sau lắc ở trên vào các đĩa thạch Luria Bertani – agar (LB-agar) 1,5% đã chuẩn bị sẵn (bổ sung Kanamycin 50µl (40mg/ml) và 100µl X-gal (40mg/ml; ghi nhãn). Mỗi đĩa thạch khoảng 2-3µl tế bào sau chuyển nạp. Ủ đĩa trong tủ ấm 37OC ít nhất 18-20 giờ.
* Chọn lọc dòng tế bào tái tổ hợp: Sau ủ 18-20 giờ, các đĩa thạch được lấy ra để chọn lọc các dòng vi khuẩn tái tổ hợp (Các khuẩn lạc màu trắng là các khuẩn lạc của vi khuẩn có khả năng mang plasmid tái tổ hợp, theo cơ chế chọn lọc X-gal). Tiếp tục cấy các khuẩn lạc trong các ống môi trường LB lỏng có bổ sung
Kanamycin, sau đó được lắc trong máy lắc điều nhiệt (200 vịng/phút, 37O
C) trong 10-20 giờ để các tế bào sinh trưởng và nhân lên với số lượng lớn.
* Tách chiết DNA tái tổ hợp: Chúng tơi sử dụng bộ hố chất AccuPrep Plasmid
Mini Extraction Kit (BIONEER) để tách chiết DNA tái tổ hợp.
* Cắt kiểm tra DNA plasmid tái tổ hợp bằng enzym EcoRI: Do vector
pCR®2.1TOPO® được thiết kế có điểm cắt của enzym giới hạn EcoRI tại hai đầu
của vùng tiếp nhận DNA ngoại lai, nên khi được cắt bằng EcoRI DNA plasmid tái tổ hợp được cắt thành hai đoạn hoặc 3 đoạn (nếu trong DNA ngoại lai có chứa điểm cắt của EcoRI). Một đoạn có kích thước 3,9kb của vector pCR®2.1TOPO®, và 1 (hoặc 2) đoạn có kích thước tương đương với đoạn DNA sản phẩm của RT-PCR được gài vào vùng nhân dòng của vector.
Sản phẩm sau cắt được điện di kiểm tra trên thạch agarose 1%. Nếu sản phẩm cắt cho kết quả tương ứng với kích thước DNA sản phẩm RT-PCR, thì DNA plasmid tái tổ hợp được thu nhận và giải trình trình tự.
2.2.4. Giải trình tự
Giải trình trình tự (DNA sequencing) là quá trình xác lập và thu nhận thành phần nucleotide của một phân đoạn DNA cần nghiên cứu. Kỹ thuật này kết hợp ba bước của một chu kì nhiệt phản ứng PCR, bao gồm: bung liên kết, mồi bám và tổng hợp sợi đơn nucleotide. Mồi sử dụng là mồi đơn, thành phần tổng hợp DNA là dideoxy-NTP (dd-NTP). Chuỗi DNA sản phẩm được xác định trình tự theo chiều 5’→ 3’ dùng chất nhuộm huỳnh quang (fluorescent dye) để đánh dấu, sử dụng
polyacrylamide và quét tia lazer dọc theo chuỗi để đọc trình tự, phân tích tự động bằng các chương trình máy tính (tin-sinh học) [2].
2.2.5. Đối chiếu và so sánh xử lí số liệu
Sử dụng các phần mềm tin-sinh học phân tích sự tương đồng giữa các gene virus và so sánh kết quả với GenBank GENEDOC2.5. Thành phần acid amin được thu nhận bằng cách sử dụng bộ mã của vi sinh vật bậc thấp (vi khuẩn) có trong Ngân hàng gen thơng qua chương trình GENEDOC2.5. Xác định mối quan hệ phả hệ được xây dựng theo phương pháp liên kết cận kề với phần mềm MEGA 4.0.
2.2.6. Xử lý số liệu bằng chƣơng trình tin-sinh học
Sử dụng máy tính Macintosh với các phần mềm SeqEd1.03, AsemblyLIGN1.9, hệ chương trình MacVector8.2 (Accelrys Inc.) để xử lí và thu nhận chuỗi gen cần nghiên cứu. Phân tích xác nhận chuỗi gen thu được thơng qua chương trình Blast trên Ngân hàng gen. Truy cập Ngân hàng gen thu nhận các chuỗi gen và xác định sự tương đồng về nucleotide giữa các gen của virus với đoạn gen thu được trong nghiên cứu. Thành phần acid amin của kháng nguyên virus được thu nhận bằng cách sử dụng bộ mã của vi sinh vật bậc thấp (vi khuẩn - bacterial code) có trong Ngân hàng gen, và so sánh thơng qua chương trình GENEDOC2.5. Xác định sơ đồ phả hệ nguồn gốc phát sinh chủng loại trên cơ sở 3 gen cấu trúc NP, M, NS của chủng virus thu nhận được thực hiện bằng phần mềm MEGA4.0 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis; theo phương pháp liên kết cận kề với thông số Neighbour Joining - NJ [2].
Chúng tơi tiến hành nghiên cứu lưu giữ và phân tích nguồn gen NP, M, NS với 2 lĩnh vực kỹ thuật chính:
1) Bằng kỹ thuật sinh học phân tử (molecular cloning technology; nghiên cứu phân lập các gen NP, M, NS từ các chủng thu thập trên vịt bị bệnh của năm 2011 tại Việt Nam, lưu giữ tồn bộ gen NP, M, NS trong vector tách dịng.
2) Bằng các chương trình tin-sinh học (bioinformatics) tiến hành phân tích các đặc tính sinh học phân tử chủ yếu là thành phần nucleotide, amino acid, nguồn gốc phả hệ dựa trên 3 gen NP, M, NS của virus đương nhiễm với một số chủng virus cúm A/H5N1 đã phân lập ở Việt Nam và trên Thế giới.
2 1 M
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. THU NHẬN, GIẢI MÃ GEN NP, GEN M VÀ GEN NS CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 CHỦNG Dk-VN-QT800 VÀ Dk-VN- QT1603
3.1.1. Tách RNA tổng số và thực hiện phản ứng RT-PCR
Mẫu bệnh phẩm trong nghiên cứu là các mẫu ở dang huyễn dịch có chứa virus cúm gia cầm của vịt mắc bệnh tại Quảng Trị được sử dụng làm nguyên liệu tách chiết RNA tổng số bằng bộ sinh phẩm tách RNA tổng số QIAamp Viral Mini Kit (Qiagen Inc.) theo quy trình hướng dẫn của nhà sản xuất. RNA tổng số sau khi tách chiết được kiểm tra bằng điện di trên thạch agarose 1% (Hình 3.1).
Hình 3.1. Kết quả kiểm tra RNA tổng số của Dk-VN-QT800 và Dk-VNQT-1603
(M: thang DNA chuẩn; giếng 1: RNA tổng số của Dk-VN-QT800;
giếng 2: RNA tổng số của Dk-VN-QT1603).
Kết quả hình 3.1 cho thấy, ở cả hai giếng tra mẫu RNA tổng số của Dk-VN- QT800 (giếng số 1) và Dk-VN-QT1603 (giếng số 2) đều cho kết quả là vệt sáng trắng, chứng tỏ RNA tổng số được tách chiết có chất lượng tốt.
Sau khi thu được RNA tổng số sẽ được dùng làm khuôn thực hiện phản ứng RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen NP, gen M và gen NS của virus cúm A/H5N1. Sử dụng bộ kit RT-PCR one- step của hãng Qiagen để thu nhận gen NP, gen M và gen NS. Tất cả các thành phần (mồi, khuôn, thành phần phản ứng) được cho vào cùng một lúc và thực hiện liên tục cả hai giai đoạn: giai đoạn chuyển đổi (RT) RNA thành cDNA và giai đoạn nhân gen (PCR).
2 kb 1,56kb 2 kb 1,56 kb 3,9 kb M 1 2 A M 1 2 3 4 B
3.1.2. Thực hiện RT-PCR, thu nhận và giải trình tự gen NP
Trong nghiên cứu để thu nhận phân đoạn 5 mã hóa gen NP của 2 chủng Dk- VN-QT800 và Dk-VN-QT1603 sử dụng RT-PCR với cặp mồi (NPF-NPR) là cặp mồi đặc hiệu của gen NP có trình tự mồi và chu trình nhiệt được trình bày ở bảng 2.1 và hình 2.2 (phần Phương pháp nghiên cứu).
Kết quả hình ảnh điện di trên thạch agarose 1% cho thấy phản ứng RT-PCR của 2 chủng nghiên cứu cho sản phẩm có kích thước khoảng 1,5 kb tương ứng với dự kiến độ dài của gen NP (Hình 3.2A).
Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR và DNA plasmid tái tổ hợp gen NP
(A): Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR trên thạch agarose 1%, M: thang DNA chuẩn, Giếng 1 và giếng 2: sản phẩm RT-PCR chủng Dk-VN-QT800 và chủng Dk-VN-QT1603; (B):
DNA plasmid tái tổ hợp cắt bằng enzym EcoRI, M: thang DNA chuẩn, giếng 1, giếng 2: DNA plasmid tái tổ hợp clone 1 và clone 2 chủng Dk-VN-QT800; giếng 3, giếng 4: DNA plasmid tái tổ
hợp clone 1 và clone 2 của chủng Dk-VN-QT1603 .
Kết quả sản phẩm RT-PCR của mỗi chủng trong nghiên cứu là một băng đơn nhất, chứng tỏ các trình tự mồi thiết kế, tiến trình thực hiện phản ứng RT-PCR, chu trình nhiệt phù hợp. Sản phẩm RT-PCR chứa toàn bộ gen NP của 2 chủng Dk-VN- QT800 và Dk-VN-QT1603 được thu nhận, tinh sạch sản phẩm RT-PCR và tiến hành dịng hóa vào vector tách dịng để thu nhận DNA tái tổ hợp, giải trình tự và lưu giữ gen trong plasmid. Hình 3.2B thể hiện kết quả tách DNA plasmid tái tổ hợp của gen NP tương ứng sau khi cắt bằng enzyme giới hạn EcoRI để kiểm tra đoạn
DNA chèn vào. Có hai băng DNA hiển thị trên thạch agarose, một băng có kích thước khoảng 3,9 kb tương ứng với kích thước của vector pCR®2.1-TOPO và một băng có kích thước khoảng 1,5 kb tương ứng với đoạn DNA từ sản phẩm RT-PCR
* 20 * 40 * 60 * ATGGCGTCTCAAGGCACCAAACGATCTTATGAACAGATGGAAACTGGTGGAGAGCGCCAGAATGCTACTGAGATC M A S Q G T K R S Y E Q M E T G G E R Q N A T E I> > 80 * 100 * 120 * 140 * AGGGCATCGGTTGGAAGAATGGTTAGTGGCATTGGGAGGTTCTACATACAGATGTGCACAGAACTCAAACTCAGT R A S V G R M V S G I G R F Y I Q M C T E L K L S> > 160 * 180 * 200 * 220 GACTATGAAGGGAGACTGATCCAGAACAGCATAACAATAGAGAGAATGGTACTTTCTGCATTTGATGAAAGGAGA D Y E G R L I Q N S I T I E R M V L S A F D E R R> > * 240 * 260 * 280 * 300 AACAGGTACCTAGAAGAACACCCCAGTGCGGGGAAGGACCCGAAGAAAACTGGAGGTCCAATTTATCGAAGGAGA N R Y L E E H P S A G K D P K K T G G P I Y R R R> > * 320 * 340 * 360 * GACGGAAAATGGGTGAGGGAGCTGATTCTGTACGACAAAGAGGAGATCCGGAGGATTTGGCGCCAAGCTAACAAT D G K W V R E L I L Y D K E E I R R I W R Q A N N> > 380 * 400 * 420 * 440 * GGAGAGGACGCAACTGCTGGCCTTACCCACCTGATGATATGGCATTCCAATCTAAATGATGCCACATATCAGAGA G E D A T A G L T H L M I W H S N L N D A T Y Q R> > 460 * 480 * 500 * 520 ACGAGAGCTCTCGTGCGTACCGGAATGGACCCCAGAATGTGCTCTCTGATGCAAGGATCAACCCTCCCGAGGAGA T R A L V R T G M D P R M C S L M Q G S T L P R R> > * 540 * 560 * 580 * 600 TCTGGGGCTGCCGGTGCAGCAGTGAAGGGGGTAGGAACAATGGTGATGGAGCTGATTCGGATGATAAAACGAGGG S G A A G A A V K G V G T M V M E L I R M I K R G> > * 620 * 640 * 660 * ATCAACGACCGGAATTTCTGGAGAGGCGAAAATGGAAGAAGAACAAAGATTGCATATGAGAGAATGTGCAACATC I N D R N F W R G E N G R R T K I A Y E R M C N I> > 680 * 700 * 720 * 740 * CTCAAAGGGAAATTCCAAACAGCTGCACAAAGAGCAATGATGGATCAAGTGCGAGAGAGCAGAAATCCTGGGAAT L K G K F Q T A A Q R A M M D Q V R E S R N P G N> > 760 * 780 * 800 * 820 GCTGAAATTGAAGATCTCATTTTTCTGGCACGGTCTGCACTCATCCTGAGAGGATCAGTAGCCCATAAGTCTTGC A E I E D L I F L A R S A L I L R G S V A H K S C> > * 840 * 860 * 880 * 900 TTGCCTGCTTGTGTGTACGGGCTTGCAGTGGCCAGCGGATATGACTTTGAGAGAGAAGGATACTCTCTGGTTAGA L P A C V Y G L A V A S G Y D F E R E G Y S L V R> > * 920 * 940 * 960 * ATAGATCCCTTCCGTCTGCTCCAAAACAGCCAGGTCTTCAGTCTCATTAGGCCAAATGAAAATCCAGCACATAAG I D P F R L L Q N S Q V F S L I R P N E N P A H K> > 980 * 1000 * 1020 * 1040 * AGCCAATTAGTGTGGATGGCATGCCACTCTGCAGCATTCGAGGACCTTAGAGTCTCAAGCTTCATCAGAGGGACA S Q L V W M A C H S A A F E D L R V S S F I R G T> > 1060 * 1080 * 1100 * 1120 AGAGTGGTCCCAAGAGGACAGCTATCCACCAGAGGGGTTCAAATTGCTTCAAATGAGAATATGGAAGCAATGGAC R V V P R G Q L S T R G V Q I A S N E N M E A M D> > * 1140 * 1160 * 1180 * 1200 TCCAACACTCTTGAACTGAGAAGTAGATATTGGGCTATAAGAACCAGGAGCGGAGGGAACACCAATCAACAGAGA S N T L E L R S R Y W A I R T R S G G N T N Q Q R> > * 1220 * 1240 * 1260 * GCATCTGCAGGACAGATCAGCGTTCAGCCTACTTTCTCGGTGCAGAGGAACCTCCCATTCGAAAGAGCGACCATT A S A G Q I S V Q P T F S V Q R N L P F E R A T I> > 1280 * 1300 * 1320 * 1340 * ATGGTAGCATTTACAGGAAATACTGAAGGCAGGACGTCTGACATGAGGACTGAAATCATAAGAATGATGGAAAGT M V A F T G N T E G R T S D M R T E I I R M M E S> > 1360 * 1380 * 1400 * 1420 GCCAGACCAGAAGATGTGTCATTCCAAGGGCGGGGAGTCTTCGAGCTCTCGGATGAAAAGGCAACGAACCCGATC A R P E D V S F Q G R G V F E L S D E K A T N P I> > * 1440 * 1460 * 1480 * GTGCCTTCCTTTGACATGAATAATGAGGGGTCTTATTTCTTCGGAGACAATGCAGAGGAGTATGACAATTAA : 1497 V P S F D M N N E G S Y F F G D N A E E Y D N *> > TRANSLATION OF Dk-VN-QT800-NP(1497BP) TRANSLATION OF Dk-VN-QT800-NP(1497BP) TRANSLATION OF Dk-VN-QT800-NP(1497BP) TRANSLATION OF Dk-VN-QT800-NP(1497BP) TRANSLATION OF Dk-VN-QT800-NP(1497BP) TRANSLATION OF Dk-VN-QT800-NP(1497BP) TRANSLATION OF Dk-VN-QT800-NP(1497BP) TRANSLATION OF Dk-VN-QT800-NP(1497BP) TRANSLATION OF Dk-VN-QT800-NP(1497BP) TRANSLATION OF Dk-VN-QT800-NP(1497BP) TRANSLATION OF Dk-VN-QT800-NP(1497BP) TRANSLATION OF Dk-VN-QT800-NP(1497BP) TRANSLATION OF Dk-VN-QT800-NP(1497BP) TRANSLATION OF Dk-VN-QT800-NP(1497BP) TRANSLATION OF Dk-VN-QT800-NP(1497BP) TRANSLATION OF Dk-VN-QT800-NP(1497BP) TRANSLATION OF Dk-VN-QT800-NP(1497BP) TRANSLATION OF Dk-VN-QT800-NP(1497BP) TRANSLATION OF Dk-VN-QT800-NP(1497BP) TRANSLATION OF Dk-VN-QT800-NP(1497BP)
cần tách dòng. DNA plasmid tái tổ hợp được giải trình tự và thu nhận chuỗi gen NP của 2 chủng nghiên cứu. Toàn bộ gen NP gồm 1497 nucleotide mã hóa cho 498 amino acid (hình 3.3, phụ lục 1.A)
Hình 3.3. Phân tích diễn giải thành phần nucleotide và amino acid của gen NP chủng DK-QT-
VN800 (Dịng trên là trình tự nucleotide, dịng dưới là trình tự amino acid tương ứng biểu thị bằng chữ cái (1 chữ cái) ký hiệu của chúng).
2 kb 1,027 kb 1,027 kb 3,9 kb 2 kb M 1 2 M 1 2 A B M 1 2 3 4
3.1.3. Thực hiện RT-PCR, thu nhận và giải trình tự gen M
Tương tự như trong phần nghiên cứu gen NP ở trên, phân đoạn 7 mã hóa gen M của 2 chủng Dk-VN-QT800 và Dk-VN-QT1603 cũng được nhân lên bằng phản ứng RT-PCR từ khuôn RNA tổng số bằng cặp mồi MAF-MAR với chu trình nhiệt tương ứng được trình bày tại chương 2.
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR trên thạch agarose 1% được trình bày ở hình 3.3A. Kết quả hiển thị ở hình 3.4A là một băng DNA sáng rõ kích thước khoảng 1 kb tương ứng với kích thước của phân đoạn gen M của hai chủng DkQT800 và DKQT1603 cần nghiên cứu.
Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR và DNA plasmid tái tổ hợp gen M
(A): Điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR trên thạch agarose 1%, M: thang DNA chuẩn, giếng 1 và giếng 2: sản phẩm RT-PCR chủng Dk-VN-QT8000 và chủng Dk-VN-QT1603 có kích thước
khoảng 1 kb; (B): DNA plasmid tái tổ hợp cắt bằng enzym EcoRI, M: chỉ thị phân tử DNA, giếng
1, giếng 2: DNA plasmid tái tổ hợp clone 1 và clone 2 của chủng Dk-VN-QT8000, giếng 3, giếng 4: DNA plasmid tái tổ hợp clone 1 và clone 2 của chủng Dk-VN-QT1603.
Hình 3.4B là kết quả điện di DNA plasmid tái tổ hợp của clone tương ứng sau khi cắt bằng enzym giới hạn EcoRI để kiểm tra đoạn DNA chèn vào. Kết quả ở hình 3.3B cho thấy, có hai băng DNA hiển thị trên thạch agarose, một băng có kích thước
khoảng 3,9 kb tương ứng với kích thước của vector pCR®2.1-TOPO và một băng có
kích thước khoảng 1 kb tương ứng với đoạn DNA từ sản phẩm RT-PCR cần tách dòng.
* 20 * 40 * 60 * ATGAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAACGTACGTTCTCTCTATCATCCCATCAGGCCCCCTCAAAGCCGAGATCGCG M S L L T E V E T Y V L S I I P S G P L K A E I A> > M S L L T E V E T 80 * 100 * 120 * 140 * CAGAAACTTGAGGATGTATTTGCAGGAAAGAACACCGATCTCGAGGCTCTCATGGAGTGGCTAAAGACAAGACCA Q K L E D V F A G K N T D L E A L M E W L K T R P> > 160 * 180 * 200 * 220